ГОСТ Р 52415-2005
Группа Н19
НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
МОЛОКО НАТУРАЛЬНОЕ КОРОВЬЕ - СЫРЬЕ
Люминесцентный метод определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов
Fresh cow's milk - raw material. Luminescent method of quantitative determination of the total amount of mesophilic aerobic and elective anaerobic microorganisms
ОКС 67.100.10
ОКП 92 2000
Дата введения 2007-01-01
Предисловие
Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения"
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН ООО "Люмтек"
2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 186 "Молоко и молочные продукты"
3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 23 декабря 2005 г. N 331-ст
4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
5 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Август 2009 г.
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте национального органа Российской Федерации по стандартизации в сети Интернет
1 Область применения
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на сырое натуральное коровье молоко - сырье (далее - молоко) и устанавливает люминесцентный метод определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) от 50 тыс. до 20000 тыс. КОЕ/см. Наименьший предел обнаружения КМАФАнМ - не менее 50 тыс. КОЕ/см.
Требования к молоку установлены в ГОСТ Р 52054.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения
ГОСТ Р 51652-2000 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия
ГОСТ Р 51917-2002 Продукты молочные и молокосодержащие. Термины и определения
ГОСТ Р 52054-2003 Молоко натуральное коровье - сырье. Технические условия
ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 2228-81 Бумага мешочная. Технические условия
ГОСТ 2405-88 Манометры, вакуумметры, мановакуумметры, напоромеры, тягомеры и тягонапоромеры. Общие технические условия
ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия
ГОСТ 3145-84 Часы механические с сигнальным устройством. Общие технические условия
ГОСТ 6709-72 Реактивы. Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 8218-89 Молоко. Метод определения чистоты
ГОСТ 9225-84 Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа
ГОСТ 10157-79 Аргон газообразный и жидкий. Технические условия
ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия
ГОСТ 12290-89 Картон фильтровальный для пищевых жидкостей. Технические условия
ГОСТ 22649-83 Стерилизаторы воздушные медицинские. Общие технические условия
ГОСТ 22967-90 Шприцы медицинские инъекционные многократного применения. Общие технические требования и методы испытаний
ГОСТ 23932-90 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Общие технические условия
ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования
ГОСТ 24861-91 (ИСО 7886-84) Шприцы инъекционные однократного применения
ГОСТ 26668-85 Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических анализов
ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу
ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний
ГОСТ 29169-91 (ИСО 648-77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте национального органа Российской Федерации по стандартизации в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться замененным (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Термины, определения, обозначения и сокращения
3.1 В настоящем стандарте применены термины по ГОСТ Р ИСО 5725-1 и ГОСТ Р 51917.
3.2 В настоящем стандарте применены следующие обозначения и сокращения:
КМАФАнМ - количество мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов;
АТФ - аденозин-5'-трифосфат;
ВРN-реагент - растворитель соматических клеток, белка и жира молока;
КОЕ - колониеобразующие единицы.
4 Методика определения
Метод основан на:
- растворении соматических клеток, белка и жира молока BPN-реагентом;
- фильтровании полученного раствора молока через бактериальный мембранный фильтр;
- растворении отфильтрованных микроорганизмов диметилсульфоксидом;
- измерении люминесценции полученного раствора, расчете молярной концентрации АТФ микроорганизмов и выражении ее значения в КОЕ/см молока.
4.1 Средства измерений и вспомогательные устройства
Прибор "Биотокс-7", обеспечивающий измерение люминесценции в диапазоне длин волн от 380 до 600 нм по [1]*.
_______________
* См. раздел Библиография. - .
Люминометрическая кювета полистирольная диаметром 10 мм, вместимостью 0,35 см, дно которой выполнено из бактериального мембранного фильтра с порами 0,45 мкм (приложение А, рисунок 1) [2].
Штатив для люминометрических кювет (приложение А, рисунок 2) [2].
Шприц медицинский вместимостью 5 см по ГОСТ 22967, ГОСТ 24861.
Наконечник резиновый к медицинскому шприцу (приложение А, рисунок 3) [2].
Колба вместимостью 5 см, 100 см, 1 дм по ГОСТ 1770.
Пипетки автоматические, позволяющие дозировать объемы: 0,02, 0,05, 0,2 и 1 см [3].
Наконечники к автоматическим пипеткам стерильные [4].
Термометр стеклянный жидкостной (нертутный), диапазон измерения 0 °С - 100 °С, цена деления шкалы 1 °С по ГОСТ 28498.
Часы механические с сигнальным устройством по ГОСТ 3145.
Шкаф сушильный, позволяющий поддерживать температуру (165±5) °С.
Стерилизатор воздушный медицинский по ГОСТ 22649 или стерилизатор паровой медицинский, позволяющие поддерживать температуру (121±2) °С.
Баня водяная, позволяющая поддерживать температуру (45±1) °С.
Перегонная установка (см. приложение Б).
Весы лабораторные с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более ±0,02 мг по ГОСТ 24104.
Установка для получения деионизированной воды по [5].
Пипетка стеклянная номинальной вместимостью 50 см 2 кл. по ГОСТ 29169.
Эксикатор по ГОСТ 23932.
Вакуумметр по ГОСТ 2405.
4.2 Реактивы и материалы
АТФ-реагент для биолюминесцентного определения АТФ, чистый сухой, содержащий люциферзу светляков, Д-люциферин, соль магния, компоненты буферной системы, стабилизаторы [6].
Вода деионизированная с электропроводимостью не более 0,1 мкСм, получаемая в соответствии с инструкцией к установке по 4.1.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
АТФ сухой с содержанием основного вещества не менее 99% [7].
BPN-реагент чистый сухой с массовой долей неионного детергента не более 5%, содержащий компоненты буферной системы и комплекс протеаз [8].
Промывочный раствор для подготовки образцов к АТФ-метрии, чистый, с массовой долей неионного детергента не более 1% [9].
Диметилсульфоксид [10].
Кислота соляная по ГОСТ 3118, х.ч.
Аргон по ГОСТ 10157.
Фильтровальная бумага по ГОСТ 12026 или фильтровальный картон по ГОСТ 12290.
Бумага мешочная по ГОСТ 2228.
Спирт этиловый по ГОСТ Р 51652.
Допускается применение других средств измерений, вспомогательных устройств с метрологическими и техническими характеристиками, а также реактивов и материалов по качеству не уступающим приведенным выше.
4.3 Отбор проб
Отбор проб - по ГОСТ 9225 и ГОСТ 26809.
4.4 Подготовка к измерениям
4.4.1 Приготовление водного раствора с массовой долей соляной кислоты от 1% до 2%
В мерную колбу вместимостью 1 дм (см. 4.1) наливают от 100 до 200 см дистиллированной воды и доливают пипеткой (см. 4.1) 50 см соляной кислоты (см. 4.2). Приливают дистиллированную воду до метки.
4.4.2 Подготовка посуды, инструментов и материалов
Лабораторную посуду, инструменты и материалы (полоски фильтровальной бумаги или фильтровального картона размером 4х12 см, завернутые в бумагу (см. 4.2), стерилизуют в соответствии с ГОСТ 26668 (пункт 1.2).
Колбу для отбора молока вместимостью 100 см (см. 4.1) кипятят в водном растворе соляной кислоты по 4.4.1 в течение 15 мин и ополаскивают дистиллированной водой. Затем колбу стерилизуют в сушильном шкафу при температуре (160±5) °С в течение 2 ч с последующим охлаждением в эксикаторе (см. 4.1) либо в стерилизаторе при температуре (121±2) °С в течение (30±1) мин с последующим охлаждением в эксикаторе (см. 4.1).
4.4.3 Очистка диметилсульфоксида с помощью перегонки
Диметилсульфоксид перегоняют в потоке аргона при температуре (72,0±0,2) °С и остаточном давлении 15 мм рт.ст. Для шлифов перегонной установки (см. 4.1) использование смазки не допускается. Перегнанный диметилсульфоксид хранят в стеклянной посуде без доступа света в течение 30 дней при температуре не выше 4 °С.
4.4.4 Подготовка раствора АТФ-реагента
В упаковку с сухим АТФ-реагентом (см. 4.2) автоматической пипеткой, позволяющей дозировать 1 см, вносят деионизированную воду по 4.2 в объеме, указанном на этикетке упаковки, и осторожно перемешивают покачиванием. Если для испытания используют несколько упаковок с сухим АТФ-реагентом, то их содержимое после добавления деионизированной воды объединяют в одну упаковку с помощью автоматической пипетки. Перед использованием раствор АТФ-реагента выдерживают от 15 до 30 мин. Полученный раствор используют в течение 6 ч.
4.4.5 Приготовление контрольного образца АТФ с молярной концентрацией () - 1·10 моль/см
Взвешивают (0,2755±0,0001) г АТФ (см. 4.2), растворяют его деионизированной водой в мерной колбе вместимостью 5 см (молярная концентрация водного раствора АТФ - 0,1 моль/см).
0,5 см водного раствора АТФ вносят в мерную колбу вместимостью 5 см и доводят объем раствора до метки диметилсульфоксидом по 4.4.3 (молярная концентрация полученного раствора АТФ в диметилсульфоксиде - 1·10 моль/см). Данную процедуру повторяют еще девять раз, последовательно растворяя 0,5 см вновь получаемых растворов диметилсульфоксидом в мерных колбах вместимостью 5 см.
Допускается использовать для приготовления контрольного образца лиофильно высушенную смесь АТФ с инертными наполнителями, обеспечивающую после ее растворения молярную концентрацию АТФ 1·10 моль/см.
4.4.6 Измерение люминесценции контрольного образца АТФ
Люминометрическую кювету помещают в кюветное отделение прибора для измерения люминесценции и последовательно вносят в нее 0,02 см контрольного образца АТФ по 4.4.5 и 0,05 см деионизированной воды, а также 0,05 см раствора АТФ-реагента по 4.4.4. Раствор перемешивают прокачиванием: трижды набирая содержимое люминометрической кюветы в наконечник автоматической пипетки вместимостью 0,05 см и возвращая его в люминометрическую кювету. Измеряют люминесценцию .
Процедуру измерения люминесценции контрольного образца АТФ проводят дважды. АТФ-реагент считают пригодным для проведения испытаний, если для среднеарифметического значения двух результатов наблюдений люминесценции выполняется условие: 500 усл.ед.
4.4.7 Подготовка пробы молока
Из объединенной пробы молока по ГОСТ 9225 отбирают 250 см молока, фильтруют его через иглопробивную ткань в соответствии с требованиями ГОСТ 8218 (см. разделы 2, 3). Предварительно ткань стерилизуют при температуре (121±2) °С в течение (30±1) мин, охлаждают в эксикаторе до температуры (20±2) °С. Предварительно поверхность установки для фильтрования молока обрабатывают этиловым спиртом (см. 4.2) и высушивают.
4.5 Проведение измерений
4.5.1 Отбирают 50 см отфильтрованного молока по 4.4.7 и помещают в колбу вместимостью 100 см, подготовленную по 4.4.2. Молоко подогревают до температуры (20±2) °С и перемешивают.
4.5.2 Автоматической пипеткой отбирают 1 см молока по 4.5.1, вносят его в упаковку с ВРN-реагентом и перемешивают ее содержимое. Упаковку выдерживают в водяной бане при (45±1) °С в течение 10 мин.
4.5.3 Люминометрическую кювету устанавливают на стопку из трех-пяти полосок фильтровальной бумаги или на одну полоску фильтровального картона по 4.4.2, помещенных в штатив для люминометрических кювет (приложение А, рисунок 2). В люминометрическую кювету автоматической пипеткой вместимостью 0,2 см вносят 0,2 см раствора по 4.5.2 и продавливают его в фильтровальную бумагу или фильтровальный картон, создавая избыточное давление воздуха с помощью шприца с резиновым наконечником (приложение А, рисунок 3). Стопку фильтровальной бумаги или полоску фильтровального картона в штативе для люминометрических кювет периодически перемещают так, чтобы после фильтрования под люминометрической кюветой она оставалась сухой.
Если фильтрование затруднено, то процедуру по 4.5.2 повторяют с увеличением времени выдерживания упаковки в водяной бане до 20 мин.
4.5.4 В люминометрическую кювету по 4.5.3 автоматической пипеткой вместимостью 0,2 см вносят 0,2 см промывочного раствора (см. 4.2) и продавливают его в фильтровальную бумагу или фильтровальный картон, создавая избыточное давление с помощью шприца с резиновым наконечником. Стопку фильтровальной бумаги (или полоску фильтровального картона) в штативе для люминометрических кювет периодически перемещают так, чтобы после фильтрования под люминометрической кюветой она оставалась сухой.
4.5.5 Подготовленную люминометрическую кювету по 4.5.4 помещают в кюветное отделение прибора для измерения люминесценции и автоматической пипеткой вместимостью 0,02 см вносят в нее 0,02 см диметилсульфоксида по 4.4.3. Через 1 мин автоматической пипеткой вместимостью 0,05 см в люминометрическую кювету вносят последовательно 0,05 см деионизированной воды и 0,05 см раствора АТФ-реагента по 4.4.4. Раствор перемешивают прокачиванием: трижды набирая содержимое люминометрической кюветы в наконечник автоматической пипетки и возвращая его в люминометрическую кювету. Измеряют люминесценцию анализируемой пробы .
4.5.6 Процедуры по 4.5.3-4.5.5 проводят дважды.
4.6 Обработка результатов
4.6.1 За результат измерений люминесценции контрольного образца принимают среднеарифметическое значение двух результатов наблюдений , если их повторяемость (сходимость) не превышает 10% среднеарифметического значения.
4.6.2 За результат измерений люминесценции анализируемой пробы принимают среднеарифметическое значение двух результатов наблюдений , если их повторяемость (сходимость) не превышает 10% среднеарифметического значения.
4.6.3 В случае, если повторяемость превышает 10%, процедуры по 4.4.6 и 4.5.2-4.5.5 повторяют.
4.6.4 Молярную концентрацию АТФ , моль/см, в анализируемой пробе рассчитывают по формуле
, (1)
где - коэффициент, учитывающий концентрирование микроорганизмов в люминометрической кювете при фильтровании раствора;
- молярная концентрация АТФ в контрольном образце, 1·10 моль/см по 4.4.6;
- среднеарифметическое значение двух результатов наблюдений люминесценции контрольного образца АТФ по 4.4.6, усл.ед.;
- среднеарифметическое значение двух результатов наблюдений люминесценции анализируемой пробы, усл.ед.
4.6.5 Количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов определяют по таблице 1.
Таблица 1
Молярная концентрация АТФ, , моль/см | КМАФАнМ, КОЕ/см | ||||||||
Менее | 0,6·10 | До | 50 тыс. | ||||||
От | 0,60·10 | до | 1,20·10 | включ. | Св. | 50 тыс. | " | 100 тыс. | включ. |
" | 1,21·10 | " | 2,70·10 | " | " | 100 тыс. | " | 200 тыс. | " |
" | 2,71·10 | " | 4,20·10 | " | " | 200 тыс. | " | 300 тыс. | " |
" | 4,21·10 | " | 7,30·10 | " | " | 300 тыс. | " | 500 тыс. | " |
" | 7,31·10 | " | 74,00·10 | " | " | 500 тыс. | " | 4000 тыс. | " |
" | 74,10·10 | " | 442,00·10 | " | " | 4000 тыс. | " | 20000 тыс. | " |
Приложение А (обязательное). Вспомогательные устройства для фильтрования молока
Приложение А
(обязательное)
Рисунок 1 - Люминометрическая полистирольная кювета
Рисунок 1 - Люминометрическая полистирольная кювета
Рисунок 2 - Штатив для люминометрической кюветы
Рисунок 2 - Штатив для люминометрической кюветы
Рисунок 3 - Резиновый наконечник к медицинскому шприцу
Рисунок 3 - Резиновый наконечник к медицинскому шприцу
Приложение Б (рекомендуемое). Перегонная установка
Приложение Б
(рекомендуемое)
1 - нагреватель; 2 - термометр; 3 - холодильник; 4 - вакуумметр; 5 - охлаждаемая склянка; 6 - приемник фракций; 7 - круглодонная колба; 8 - капилляр
Рисунок Б.1
Библиография
[1] | ЮУВА 414236.001 ТУ* |
________________ | |
[2] | Каталог ООО "Люмтек", N по каталогу LR09 или каталог фирмы New Horizons Diagnostics Corp. США, N по каталогу 89-117021 |
[3] | ТУ 9452-002-33189998-2002 Дозаторы пипеточные с двойным термостатированным цветным корпусом, фиксированными и переменными объемами одно- и многоканальные "Колор" |
[4] | ТУ 9452-002-33189998-2002 Наконечники полимерные одноразовые к дозаторам пипеточным НП - "Термоэлектрон" |
[5] | Каталог фирмы MilIipore, Франция, N по каталогу ZMQS500TY |
[6] | ТУ 2639-001-17919612-2002 АТФ-реагент для биолюминесцентного определения АТФ. Чистый |
[7] | Каталог фирмы Sigma, N по каталогу А7699 |
[8] | ТУ 2639-002-17919612-2002 ВРN-реагент. Чистый |
[9] | ТУ 2639-003-17919612-2002 Промывочный раствор для подготовки образцов к АТФ-метрии. Чистый |
[10] | Диметилсульфоксид Р 75/244/9, утвержденный Фармакологическим Государственным Комитетом Минздрава России от 15.03.99 |
__________________________________________________________________________________
УДК 637.12.04/07:576.8:006.354 ОКС 67.100.10 Н19 ОКП 92 2000
Ключевые слова: натуральное коровье молоко, сырье, люминесценция, метод, микроорганизмы, аэробные микроорганизмы, факультативно-анаэробные микроорганизмы, общая бактериальная обсемененность, аденозин-5'-трифосфат
__________________________________________________________________________________
Электронный текст документа
и сверен по:
официальное издание
Молоко и молочные продукты.
Общие методы анализа: Сб. ГОСТов. -
М.: Стандартинформ, 2009