ГОСТ Р 50373—92
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ стандарт РОССИЙСКОЙ федерации
ЖЕЛЕЗЫ ПОДЖЕЛУДОЧНЫЕ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И СВИНЕЙ ЗАМОРОЖЕННЫЕ
ТЕХНИЧЕСКИЕ УСЛОВИЯ
Издание официальное
БЗ 2-92/141
ГОССТАНДАРТ РОССИИ Москва
УДК 615.361.37.002.3:006.354
Группа Н15
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ЖЕЛЕЗЫ ПОДЖЕЛУДОЧНЫЕ
КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
И СВИНЕЙ ЗАМОРОЖЕННЫЕ
ГОСТ Р Технические условия
е 50373—92
Frozen, pancreases of cattle and pigs.
Specifications
ОКП 92 1831 134-0, 92 1833 1340
Дата введения
01.01.94
Настоящий стандарт распространяется на замороженные поджелудочные железы крупного рогатого скота и свиней, признанные ветеринарным контролем годными для производства инсулина.
Требования настоящего стандарта являются обязательными.
1. ТЕХНИЧЕСКИЕ ТРЕБОВАНИЯ
Поджелудочные железы должны быть собраны раздельно от каждого вида скота и обработаны по технологической инструкции с соблюдением санитарных правил для предприятий мясной промышленности и соответствовать требованиям настоящего стандарта.
1.1. Характеристики
1.1.1. В зависимости от вида скота поджелудочные железы подразделяют на:
поджелудочные железы крупного рогатого скота; поджелудочные железы свиней.
В зависимости от качества поджелудочные железы подразделяют на два сорта: первый и второй.
Не допускается смешение поджелудочных желез разных видов скота.
1.1.2. По органолептическим и физико-химическим показателям поджелудочные железы должны соответствовать требованиям, указанным в табл. 1.
Издание официальное
© Издательство стандартов, 1993
Настоящий стандарт не может быть полностью или частично воспроизведен, тиражирован и распространен без разрешения Госстандарта России 2—1685
Характеристика и норма для поджелудочной железы
Наименование показателя
крупного рогатого скота
свиней
I сорта
II сорта
I сорта
II сорта
Внешний вид
Цвет
.Температура внутри блока или отдельной железы при приемке, °C, не выше
Массовая доля жира, %, не более
Массовая доля инсулина, Ед/кг, не менее
Железы должны быть очищены от наружного жира и прирезей соединительной ткани, иметь цельную поверхность без повреждений и заморожены поштучно или в виде пластин или блоков толщиной не более 5 см
От бледно-желтого до розового с белыми нитевидными' включениями
От розового с желтоватым оттенком до розовато-красного
Минус 18
5 | 7 | 8 |
эооо | 4000 | 5'000 |
.12
4000
1.2. Маркировка
1.2.1. В каждый ящик вкладывают ярлык с указанием: наименования предприятия-изготовителя, его подчиненности
и (или) его товарного знака;
наименования железы (с указанием вида скота) и ее сорта; даты сбора железы;
массы нетто и брутто, кг;
срока и условий хранения;
номера упаковщика;
обозначения настоящего стандарта.
1.2.2. Транспортная маркировка — по ГОСТ 14192 с нанесением манипуляционного знака «Ограничение температуры».
Маркировку, характеризующую продукцию, наносят на каждую единицу тары несмывающейся непахнущей краской при помощи штампа, трафарета или наклеивания ярлыка с указанием дополнительных данных:
наименования предприятия-изготовителя, его подчиненности и (или) его товарного знака;
наименования железы (с указанием вида скота) и ее сорта; даты сбора железы;
массы нетто и брутто, кг;
срока и условий хранения;
обозначения настоящего стандарта.
1.3. Упаковка
1.3.1. Замороженные поджелудочные железы одного вида скота и сорта упаковывают в дощатые ящики по ГОСТ 13361 или в ящики из гофрированного картона по ГОСТ 13513.
1.3.2. Ящики должны быть чистыми, сухими, выстланы внутри полиэтиленовой пленкой по ГОСТ 10354. Допускаются другие полимерные пленки, разрешенные к применению органами здравоохранения. В заполненных ящиках выступающие края пленки должны полностью закрывать сверху поджелудочные железы. Укладывание поджелудочных желез в ящики должно быть плотным, не допускающим их перемещения при встряхивании.
2. ПРИЕМКА
2.1. Поджелудочные железы принимают партиями. Под партией понимают любое количество замороженных поджелудочных желез одного вида скота и сорта, предназначенное к одновременной сдаче-приемке и оформленное одним документом о качестве установленной формы.
2.2. Соответствие упаковки, маркировки требованиям настоящего стандарта и отсутствие следов подмокания и подтеков проверяют на каждом ящике.
2.3. Для проверки соответствия качества поджелудочных желез требованиям настоящего стандарта из разных мест партии отбирают выборку в. объеме 5% упаковочных единиц, но не менее 5 ящиков.
2.4. При получении неудовлетворительных результатов испытаний хотя бы по одному показателю по нему проводят повторные испытания удвоенного количества выборок, взятых от той же партии. Результаты повторных испытаний распространяют на всю партию.
2.5. При повышенной массовой доле жира в поджелудочных железах второго сорта они могут быть приняты по согласованию с потребителем.
2.6. Массовую долю инсулина определяют по требованию потребителя.
3. МЕТОДЫ ИСПЫТАНИЙ
3.1. Отбор и подготовка проб
Для проведения испытаний при замораживании поджелудочных желез поштучно берут не менее чем по 5 желез из каждого ящика, а при замораживании поджелудочных желез в блоках из разных слоев каждого ящика, отобранного в выборку, отбирают, точечные пробы массой 180—200 г. Из точечных проб составляют объединенную пробу массой (1000±20) г, измельчают на мясО-
2*
рубке и тщательно перемешивают, не допуская поднятия температуры в измельченной пробе выше 4°С.
3.2. Определение внешнего вида и цвета
Внешний вид и цвет замороженных поджелудочных желез определяют визуально при дневном свете.
Целостность желез и наличие на них прирезей жировой и соединительной тканей определяют после частичного оттаивания взятых на анализ желез путем визуального осмотра.
3.3. Определение температуры
3.3.1. Аппаратура
Термометр стеклянный жидкостной (не ртутный) по ГОСТ 27544, вмонтированный в металлическую оправу, с диапазоном измерения от минус 38 до 0°С с допускаемой погрешностью измерения ±ГС.
3.3.2. Проведение испытания
В замороженной поштучно или в.виде блоков (пластин) поджелудочной железе делают отверстие и термометром измеряют температуру на глубине (2,0+0,5) см. Отверстие можно сделать коловоротом вручную. Сверло коловорота должно быть предварительно охлаждено до температуры не выше минус 18°С.
3.4. Оп р еде ле н ие массовой доли жира с использованием экстракционного аппарата Сокслета
3.4.4. Аппаратура, материалы, реактивы
Весы лабораторные по ГОСТ 24104 общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г.
Шкаф сушильный, обеспечивающий заданный температурный режим (105±0,5)°С.
Эксикатор 2—290 по ГОСТ 25336.
Аппарат Сокслета с экстракционной колбой вместимостью 150 см3.
Стаканчики для взвешивания СВ-24/10 по ГОСТ 25336.
Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.
Песок очищенный.
Вата обезжиренная.
Эфир петролейный по ТУ 6--02—1244 с температурой кипения 40—60°С или эфир этиловый по ТУ 7506804—97, х.ч.
3.4.2. Проведение испытания
5 г измельченной поджелудочной железы взвешивают с точностью до 0,01 г в предварительно доведенном до постоянной массы стаканчике с (5,5±0,5) г очищенного песка. Навеску железы тщательно перемешивают с песком и высушивают в сушильном шкафу при температуре ('Ю5±0,5)°С в течение 2 ч. Высушенную навеску количественно переносят в бумажную гильзу, на дно которой кладут кусочек обезжиренной ваты. Стаканчик после переноса высушенной навески протирают ватой» смоченной эфиром» и помещают ее в гильзу. Гильзу тщательно закрывают, высушивают в сушильном шкафу при температуре (105ч=0,5)°С . до постоянной массы и помещают в экстрактор аппарата Сокслета-Экстракцию ведут 6 ч при 6—10 сливах экстракта в 1 ч. Полноту обезжиривания проверяют, нанося на фильтровальную бумагу каплю растворителя, стекающего из экстрактора. Процесс считают законченным при отсутствии жирного пятна на бумаге после испарения растворителя. По окончании экстракции гильзу высушивают сначала под тягой, потом в сушильном шкафу при температуре (105±0,5)°С до постоянной массы.
3.4.3. Обработка результатов
3.4.3.1. Массовую долю жира (Л") в процентах вычисляют по формуле
_(т—тх) ■ 100
где пг — масса гильзы с навеской до экстрагирования, г; mi — масса гильзы с навеской после экстрагирования, г; пг2— масса навески поджелудочной железы, г.
3.4.3.2. За окончательный результат испытаний принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений, рассчитанное до второго и округленное до первого десятичного знака.
3.4.3.3. Допускаемое расхождение между результатами двух параллельных определений при Р==0,95 не должно превышать 14% по отношению к среднему арифметическому значению.
3.4.3.4. Допускаемое расхождение между результатами испытаний, проведенных в двух разных лабораториях, при Р = 0,95 не должно превышать 18% по отношению к среднему- арифметическому значению.
3.5. Определение массовой доли жира с использованием жиромера
3.5.1. Аппаратура, материалы, реактивы
Весы лабораторные по ГОСТ 24104 общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г.
Центрифуга ЦЛМП-24.
Термометр стеклянный жидкостной (не ртутный) по ГОСТ 27544 с диапазоном измерения температуры 0—100°С с допускаемой погрешностью измерения ± ГС.
Баня для подогрева жиромеров по ТУ 46—22—761.
Жиромеры по ГОСТ 23094.
Штатив химический.
Пробирки П4—10—14/23 ХС по ГОСТ 25336.
Бюретка 1—2—25—0,1 по ГОСТ 20292.
Спирт изоамиловый по ГОСТ 5830, ч.д.а., плотностью
0,8108 г/см3.
Кислота серная по ГОСТ 4204, х.ч., плотностью 1,835 г/см3, раствор 600 г/дм3.
3.5.2. Проведение испытания
Навеску измельченной поджелудочной железы массой (5± ±0,1) г помещают в пробирку, приливают 5 см3 600 г/дм3 раствора серной кислоты и гидролизуют на водяной бане при температуре (78±2)°С, периодически тщательно встряхивая содержимое пробирки до получения однообразной бурой массы.
Содержимое пробирки количественно переносят в жиромер, многократно обмывая ее стенки 600 г./дм3 раствором серной кислоты: Пробы переносят при температуре (78±2)°С.
В молочный жиромер переносят гидролизат поджелудочной железы крупного рогатого скота, в сливочный жиромер — гидролизат поджелудочной железы свиней.
В жиромер из бюретки приливают 4 см3 изоамилового спирта, доводят объем жиромера до плечиков, приливая из бюретки 600 г/дм3 раствор серной кислоты. Смесь перемешивают, переворачивая жиромер 7—10 раз, затем пробкой вниз помещают на 10 мин в предварительно нагретую до (78±2)°С водяную баню, после чего жиромеры переносят в центрифугу, располагая их узким концом к центру, и центрифугируют при ско-рости 1500 об/мин в течение 10 мин. После чего жиромеры вновь помещают на 10 мин в водяную баню и затем снимают показатель жиромера.
При отсутствии четкой границы раздела между жиром и растворителем взбалтывание, нагревание и центрифугирование повторяют.
3.5.3. Обработка результатов
З.5.З.1. Массовую долю жира (%i) в процентах вычисляют по формуле
'”i
где h — высота столбика жира по шкале жиромера, деления;
пг—масса жира, соответствующая одному делению жиромера (0,011564 г — одно деление молочного жиромера; 0,052343 г — одно деление сливочного жиромера), г;
zhi — масса навески поджелудочной железы, г.
3.5.3.2. За окончательный результат испытаний принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений, рассчитанное до второго и округленное до .первого десятичного знака.
3.5.3.3. Допускаемое расхождение между результатами двух параллельных определений при Р = 0,95 не должно превышать 15% по отношению к среднему арифметическому значению.
3.5.3.4. Допускаемое расхождение между результатами испытаний, проведенных в двух разных лабораториях, не должно превышать 20% по отношению к среднему арифметическому значению при Р = 0,95.
3.6. Определение массовой доли инсулина методом ионообменной хроматографии на колонках
3.6.1. Аппаратура, материалы, реактивы
Весы лабораторные по ГОСТ 24104 общего назначения 3-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 500 г.
Весы лабораторные по ГОСТ 24104 общего назначения 2-го .класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г.
Мясорубка бытовая по ГОСТ 4025 или электромясорубка бытовая по ГОСТ 20469 с отверстиями решетки диаметром от 3 до 4 мм.
Колориметр фотоэлектрический лабораторный по нормативнотехнической документации с устройством для отсчитывания значения оптической плотности и светофильтром с Хтах= (600+10) нм или спектрофотометр для измерения в видимой области спектра.
Потенциометр с погрешностью измерения не более ±0,05 pH. Центрифуга ЦЛР-1.
Термометр стеклянный жидкостной по ГОСТ 27544 с диапазоном измерения от 0 до 100°С с допускаемой погрешностью измерения ±1°С.
Мешалка.
Тарелки мелкие столовые диаметром 20 см.
Кювета эмалированная для окрашивания хроматограмм.
Пробирки П4—10—14/23 ХС по ГОСТ 25336.
Воронка В-56—80 ГХС по ГОСТ 25336.
Цилиндры 1—25, 1—50, 1 —100 по ГОСТ 1770.
Колонки стеклянные диаметром (30±5) мм, высотой (400±' ’±50) мм.
Пипетки 4—2—1; 4—2—2; 4—2—5; 8—2—0,1 по ГОСТ 20292.
Марля медицинская по ГОСТ 9412.
Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.
Бумага хроматографическая быстрая (ленинградская или импортная) марки Б или С.
Вата медицинская гигроскопическая по ГОСТ 5556.
Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, х.ч., растворы 1 и
0,01 моль/дм3 и 200 г/дм3.
Кислота соляная по ГОСТ 3118, х.ч., плотностью 1,19 г/см3, растворы 1; 0,5 и 0,1 моль/дм3, 180 г/дм3.
Кислота серная по ГОСТ 4204, х.ч., плотностью 1,835 г/см3.
Кислота уксусная ледяная по ГОСТ 61, х. ч„ растворы 20 и 800 г/дм3.
Медь (II) серно-кислая 5-водная по ГОСТ 4165, ч.д.а., раствор 125 г/дм3.
Индикатор бромфеноловый синий водорастворимый по ТУ 6—09—3719, ч.д.а.
Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962, растворы 650, 700 и 800 г/дм3.
Инсулин кристаллический с активностью (25± 1) Ед/мг.
Аммоний уксуснокислый по ГОСТ 3117, ч.д.а., раствор
0,2 моль/дм3.
Аммоний хлористый по ГОСТ 3773, х.ч., раствор 0,2 моль/дм3.
Аммиак по ГОСТ 3760, ч.д.а., плотностью 0,91 г/.см3, раствор 125 г/дм3
Кислота трихлоруксусная кристаллическая по ТУ 6—09—1926, ч., раствор 100 г/дм3.
Бутанол-1 по ГОСТ 6006, ч.д.а., плотностью 0,8092 г/см3.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Катионит КУ 23 И по ТУ 6-05—211—971.
Допускается использование аппаратуры с техническими и метрологическими характеристиками не хуже, а также реактивы по качеству не ниже указанных в настоящем стандарте.
3.6.2. Подготовка к испытанию
3.6.2.1. Приготовление системы растворителей
Бутанол-1, 800 г/дм3 раствор уксусной кислоты и дистиллированную воду смешивают в соотношении 3:1:5.
3.6.2.2. П риготовление стандартного раствора инсулина
Навеску инсулина (9,6±0,1) мг с активностью (25±1) Ед/мин растворяют в 6 см3 раствора соляной кислоты концентрации 0,1 моль/дм3. Полученный раствор содержит 40 Ед инсулина в 1 см3.
3.6.2.3. Приготовление красителя бром фенолового синего
Навеску 0,5 г индикатора бромфенолового синего водорастворимого растворяют в 40 см3 дистиллированной воды, разводят в 920 см3 раствора уксусной кислоты концентрации 20 г/дм3, затем добавляют 40 см3 раствора серно-кислой меди концентрации 125 г/дм3.
3.6.2.4. Приготовление 0,2 моль/дм3 раствора аммония уксуснокислого pH (5,25+0,05)
Навеску 15,4 г аммония уксуснокислого растворяют в дистиллированной воде и доводят объем раствора до 1 дм3, pH корректируют ледяной уксусной кислотой.
3.6.2.5. Приготовление 0,2 моль/дм3 раствора аммония хлористого pH (9,5±О,2)
Навеску 10,7 г аммония хлористого растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до 1 дм3. pH раствора регулируют раствором соляной кислоты концентрации 180 г/дм3 или раствором аммиака концентрации 125 г/дм3.
3.6.2.6. Подготовка, катионита КУ 23 И
Предварительно просеянный катионит КУ 23 И диаметром зерен не менее 0,3 мм во влажном состоянии вносят в колонки, предварительно заполненные дистиллированной водой. Через слой' катионита (на 60 г суховоздушной смолы) пропускают 2 дм3 раствора гидроокиси натрия концентрации 1 моль/дм3, 1 дм3 дистиллированной воды, 2 дм3 раствора соляной кислоты концентрации 1 моль/дм3, 100 см3 раствора этилового спирта концентрации 700 г/дм3. Если катионит не был в употреблении, то описанную^ операцию повторяют дважды. Скорость пропускания растворов 10 см3/мин.
3.6.3. Проведение испытания
К навеске измельченной поджелудочной железы массой 500 г добавляют 11,75 дм3 раствора этилового спирта концентрации 800 г/дм3, подкисленного 2,25 см3 концентрированной серной кислоты, и перемешивают в течение 7 мин мешалкой при температуре (15±1)°С со скоростью (13н=1) об/мин, затем приливают 16 см3 раствора соляной кислоты концентрации 0,5 мсль/дм3 й продолжают перемешивание в течение 2 ч. После чего отделяют экстракт от жмыха при помощи воронки через двойной слой марли. Жмых заливают 0,75 дм3 раствора этилового спирта концентрации 650 г/дм3 и перемешивают в течение 40 мин. Отделяют экстракт от жмыха через двойной слой марли. Первый и второй экстракты объединяют, добавляют 200 г/дм3 раствор гидроокиси натрия, устанавливая pH (4,5нь0,1) (потенциометрически).
Образовавшийся осадок через 5 мин отделяют фильтрацией через складчатый бумажный фильтр. Полученный фильтрат после установления в нем pH (3,5±0,1) (потенциометрически) 1180 г/дм3 раствором соляной кислоты направляют на сорбцию.
Сорбцию инсулина осуществляют на предварительно подготовленном катионите КУ 23 И, помещенном в количестве (60±5) г в стеклянную колонку диаметром (30±5) мм и высотой (400± ±50) мм, путем подачи экстракта сверху со скоростью (10± ±2) см3/мин. По окончании сорбции пропускают 700 г/дм3 раствор этилового спирта со скоростью (10±2) см3/мин до полного' удаления следов жира.
Окончание обезжиривания определяют в пробирке по исчезновению мутного жирового кольца при наслаивании 1—2 см3 исходящего из колонки спиртового раствора на 5—6 см3 воды.
Зятем удаляют балластные белки путем пропускания 0,2 моль/дм3 раствора аммония уксуснокислого с pH (5,25±0,05) со скоростью (10+2) см3/мин. Расход раствора аммония уксуснокислого составляет 3 дм3 на 60 г катионита. Полноту удаления балластных веществ контролируют спектрофотометрически при длине волны 280 нм. Оптическая плотность не должна превышать 0,05.
Десорбцию инсулина осуществляют путем пропускания через колонку 0,2 моль/дм3 раствора аммония хлористого с pH (9,5+‘ ±0,2) со скоростью (2+1) см3/мин. Начало сбора элюата определяют по появлению помутнения при добавлении 0,3 см3 элюата к 0,3 см3 раствора трихлоруксусной кислоты концентрации 100 г/дм3. Конец элюирования определяют по слабоположительной реакции с 100 г/дм3 раствором трихлоруксусной кислоты или спектрофотометрически до оптической плотности не меньше 0,05.
Объем элюата измеряют, в кубических сантиметрах, определяют его активность методом круговой бумажной хроматографии.
Примечание. Перед нанесением на хроматограмму элюат свиной поджелудочной железы разбавляют дистиллированной водой, подкисленной моль/дм3-раствором соляной кислоты до pH (2.5±Ю,1), в соотношении 1:1. -Соответственно в формуле расчета массовой доли инсулина Dx умножают на 2.
По окружности бумаги для хроматографирования на расстоянии 2 см от центра круга пипеткой наносят по 0,02—0,03 см3 элюата (в четыре точки) и стандартного раствора инсулина (в две точки). Диаметр хроматограммы 20 см. Хроматограммы помещают в мелкие тарелки диаметром около 20 см, куда предварительно наливают систему растворителей (50±5) см3. Бумажный круг соединяют с системой растворителей при помощи фитиля, сделанного из той же бумаги, и накрывают тарелкой.
Процесс хроматографирования осуществляют при температуре 18—25°С в течение 3 ч. По окончании процесса хроматографирования хроматограмму высушивают под тягой, затем помещают на 10 мин в кювету с красителем. Окрашенную хроматограмму несколько раз промывают в кювете 20 г/дм3 раствором уксусной кислоты (промывной раствор должен быть бесцветным).
Полученная хроматограмма имеет два пятна стандартного раствора и четыре пятна испытуемого раствора. Каждое инсулиновое пятно вырезают, измельчают, помещают в отдельную пробирку и элюируют 4 см3 0,01 моль/дм3 раствора гидроокиси натрия в течение 20 мин. Элюат колориметрируют при зеленом светофильтре (длина волны 530—540 нм) в кювете с расстоянием ■между рабочими гранями 10 мм.
3.6.4. Обработка результатов
3.6.4.1. Массовую долю инсулина (Х2) в Ед на 1 кг желез вычисляют по. формуле
где Dx— оптическая плотность исследуемого раствора;-
Ос— оптическая плотность стандартного раствора;
Сс— активность в Ед на 1 см3 стандартного раствора;
V — объем элюата, см3;
К—коэффициент пересчета содержания инсулина и инсулиноподобных белков, обладающих гипогликемической активностью в экстракте (для поджелудочной железы крупного рогатого скота — 0,5; свиней — 0,2);
2-— коэффициент пересчета на *1 кг поджелудочной железы.
3.6.4.2. За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений, рассчитанное до второго и округленное до первого десятичного знака.
3.6.4.3. Допускаемое расхождение между результатами двух параллельных определений при Р = 0,95 не должно превышать 10% по отношению к среднему арифметическому значению.
3.6.4.4. Допускаемое расхождение между результатами испытаний, проведенных . в двух разных лабораториях, при Р = 0,95 не должно превышать 10% по отношению к среднему арифметическому значению.
3.7. Определение массовой доли инсулина иммунореактивным методом
3.7.1. Аппаратура, материалы, реактивы
Весы лабораторные по ГОСТ 24104 общего назначения 3-го класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 500 г.
Весы' лабораторные по ГОСТ 24104 общего назначения 2-го класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г.
Мясорубка бытовая по ГОСТ 4025.
Микроизмельчитель ткани РТ-1 по ТУ 64—1—:1505. Потенциометр с погрешностью измерения не более ±0,05 pH. Центрифуга лабораторная типа К-23 или аналогичная. Центрифуга с горизонтальным ротором и охлаждением.
Термостат лабораторный, обеспечивающий поддержание заданного температурного режима 30—50°С.
Гамма-счетчик колодезного типа (Гамма-1, Гамма-2, Гамма-800 или аналогичный).
Пипетки полуавтоматич-еские типа КПД по ТУ П52.706.003. Наконечники для пипеток по ТУ П58.523.490.
Штатив лабораторный для пробирок.
Термометр стеклянный технический по ГОСТ 27544 с диапазоном измерения 0—100°С с допускаемой погрешностью измерения ±'1°С.
Встряхиватель лабораторный .
Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026. Пробирки П4—5—14/23 ХС по ГОСТ 25336.
Стаканы В-1—250, В-1—600 по ГОСТ 25336.
Колбы мерные 2—50—2, 2—'100—2, 2—т200—2, 2—1000—2 по ГОСТ 1770.
Цилиндры 1—100, 1:1 000 по ГОСТ 1770.
Ингибитор протеаз (соевый, яичный, «Гордокс» или аналогичный).
Сыворотка крови крупного или мелкого рогатого скота.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Кислота соляная по ГОСТ 31'18, х.ч., плотностью 1,19 г/см3,, раствор 0,01 моль/дм3.
Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, х.ч.
Аммоний серно-кислый безводный по ГОСТ 3769, х. ч.
Натрий фосфорно-кислый однозамещенный по ГОСТ 245, ч.д.а.у раствор 0,2 моль/дм3.
Натрий фосфорно-кислый двузамещенный по ГОСТ 4172, ч.д.а., раствор 0,2 моль/дм3.
Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962.
Кислота ортофосфорная по ГОСТ 6552, х.ч., плотностью 1,72 г/см3.
Набор реактивов «РИА—ИНС—ПГ—125f» производства Института биоорганической химии АН БССР.
3.7.2. Подготовка к испытанию
3.7.2.1. П риготовление насыщенного раствора аммония серн о-к ислого
516,5 г аммония серно-кислого помещают в колбу вместимостью 1 дм3, приливают в нее 500 см3 горячей дистиллированной воды. После полного растворения соли приготовленный раствор охлаждают до комнатной температуры. Срок хранения раствора 1 мес.
3.7.2.2. Приготовление иммуноглобулинов, вво-водных от инсулина
К 58 см3 сыворотки крови прибавляют 42 см3 насыщенного-раствора аммония сернокислого и тщательно перемешивают, затем центрифугируют при 3600 об/мин в течение 20 мин. Надосадо.Чную жидкость сливают, осадок растворяют в дистиллированной воде: в объеме, равном исходному объему сыворотки крови. Таким образом проводят трехкратное переосаждение иммуноглобулинов при вышеуказанных условиях.
Перед последним осаждением в пробирки вместимостью 5 см31 разливают по 2 см3 раствора иммуноглобулинов, а затем в каждую пробирку добавляют по 1,5 см3 насыщенного раствора аммония'сернокислого. Содержимое пробирок тщательно перемешивают, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость сливают, пробирки оставляют в наклонном положении на фильтровальной бумаге для удаления остатков раствора, после чего пробирки закрывают пробками.
Полученные таким образом иммуноглобулины хранят в морозильной камере бытового холодильника в течение 2 мес. Перед употреблением осадок размораживают и растворяют в 2 см3 дистиллированной воды.
3.7.2.3.. Приготовление фосфатного буфера с
pH (7,5±0,1)
В мерную колбу вместимостью 200 см3 вносят 81,0 см3 раствора натрия фосфорно-кислого двузамешенного концентрации 0,2 моль/дм3 и 19,0 см3 раствора натрия фосфорнокислого однозамещенного концентрации 0,2 моль/дм3. Содержимое колбы перемешивают и измеряют pH. Убедившись, что pH равно (7,5± ±0,1), объем раствора в колбе доводят дистиллированной водой до метки. Раствор хранят при температуре 4°С.
3.7.2.4. Приготовление фосфатного буфера с pH
7,4, содержащего ингибитор протеаз в количестве 300 ингибирующих единиц в 1 см3
Приготовление раствора зависит от используемого для проведения анализа ингибитора протеаз. При использовании ингибитора протеаз «Гордокс», содержащего 10000 ингибирующих единиц в 1 см3, 1,5 см3 содержимого ампулы переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3, и доводят объем колбы фосфатным буфером до 50 см3. Раствор должен быть свежеприготовленным и охлажденным до температуры 4°С.
3.7.2.5. Пр и го то в л ен и е подкисленной воды для разведения проб
В стакан вместимостью 500 см3 наливают 250 см3 дистиллированной воды и при постоянном перемешивании малыми порциями приливают 0,01 моль/дм3 раствор соляной кислоты до достижения в воде pH 4,0 (потенциометрически). Приготовленную таким образом воду хранят в холодильнике при температуре 4°С.
3.7.2.6. Приготовление 0,05 моль/дм3 раствора фосфатного буфера, содержащего 150 ингибирующих единиц в 1 см3
В мерную колбу вместимостью 50 см3 вносят 25 см3 фосфатного буфера, содержащего 300 ингибирующих единиц в 1 см3, и объем раствора в колбе доводят подкисленной до pH 4,0 водой до метки. Раствор готовят перед употреблением.
3.7.2.7. П риготовление первого экстрагирующего раствора
167 см3 дистиллированной воды смешивают с 833 см3 этилового спирта, а затем к раствору прибавляют 13,6 см3 концентрированной ортофосфорной кислоты. Раствор готовят перед употреблением и охлаждают до температуры 4°С.
3.7.2.8. Приготовление второго экстрагирующего раствора
375 см3 дистиллированной воды смешивают с 625 см3 96° градусного этилового спирта, затем к раствору прибавляют 2,7 см3, концентрированной ортофосфорной кислоты.
3.7.2.9. Приготовление растворов калибровочных проб, антисыворотки, 125Ги нс у ли на и буферного раствора
Растворы калибровочных проб, антисыворотки и 125/-инсулина готовят из набора реактивов «РИА-ИНС-ПГ—125/» в соответствии с инструкцией по применению, утвержденной в установленном порядке. Буферный раствор и раствор полиэтиленгликоля в; данном наборе реактивов поставляют готовым к употреблению.
3.7.2.10. П о д г о т о в к а сырья к испытанию
Навеску 100 г измельченной поджелудочной железы гомогенизируют в 4-кратном объеме первого экстрагирующего раствора на. микроизмельчителе тканей РТ-1 в течение 5 мин при 8000 об/мин,, а затем в течение 10 мин при 6000 об/мин. По окончании гомогенизации на РТ-1 измеряют объем полученного гомогената (И]).
10 см3 гомогената помещают в стакан стеклянного гомогенизатора и продолжают дальнейшее измельчение ткани в течение 10 мин, а затем переносят его в центрифужный стакан или пробирку и центрифугируют в течение (25±5) мин в центрифуге с охлаждением при 5000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают в мерный цилиндр и измеряют ее объем. К осадку приливают второй экстрагирующий раствор в объеме, равном объему надосадочной жидкости, и стеклянной палочкой хорошо перемешивают осадок с раствором. После перемешивания содержимое стакана или центрифужной пробирки переносят в стакан стеклянного гомогенизатора и проводят гомогенизацию осадка в течение 10 мин, не допуская поднятия температуры при гомогенизации в растворе выше 4°С. Гомогенат переносят в центрифужный стакан или пробирку и проводят центрифугирование в течение (25±' ±5) мин в центрифуге с охлаждением при 6000 об/мин. Надосадочную жидкость присоединяют к первому экстракту, перемешивают содержимое цилиндра стеклянной палочкой и измеряют общий объем объединенных экстрактов (Va).
0,1 см3 объединенного экстракта последовательно разводят охлажденной до 4°С подкисленной до pH 4,0 водой в Ю1, 102, 103 и 104 раз.
Из полученных разведений 103 и 104 отбирают по 0,25 см3 раствора и смешивают с равным количеством фосфатного буфера, содержащего 300 Ед/см3 ингибитора протеаз.
3.7.3. Проведение испытания
В пробирки при комнатной температуре вносят растворы реагентов в последовательности и количестве, указанных в табл. 2.
.Таблица 2 смэ
Реагенты в порядке нх внесения | Количество реагентов, вносимых в пробирки: | |||
Т | н | к | п | |
Буферный раствор | 0,4 | О.2 | 0,1 | 0,1 |
125/-инсулин | 0.1 | 0,1 | 0,1 | 0.1 |
Калибровочные пробы | — | KtfO.l | 0,1 | — |
Определяемые пробы | ■— | — | 1— | 0,1 |
Антисыворотка | — | — | 0.1 | 0,1 |
Иммуноглобулины | — | — | — | 0.1 |
0,05 моль/дм3 фосфатный | ||||
буфер | од | 0,1 |
Примечание. Т — общая активность 125/-инсулина, добавляемого в одну пробирку;
Н— неспецифнческое связывание для калибровки;
К— калибровочные пробы; П—' определяемые пробы.
Содержимое пробирок тщательно перемешивают и инкубируют 3—4 ч при температуре (37±1)°С в термостате. После инкубации в каждую пробирку, кроме пробирок Т, добавляют по 0,8 см3 охлажденного раствора полиэтиленгликоля. Содержимое пробирок интенсивно перемешивают в течение 5 мин на встряхи-вателе. Все пробирки, кроме пробирок Т, одновременно центрифугируют в центрифуге с горизонтальным ротором и охлаждением в течение 20 мин при 3000 об/мин.
После центрифугирования из всех пробирок, кроме пробирок Т, одновременно сливают надосадочную жидкость. Для удаления остатков жидкости пробирки опрокидывают на фильтровальную бумагу.
Все пробирки с осадками и пробирки Т помещают в гамма-счетчик и измеряют скорость счета в каждой пробирке. Время счета 1 мин.
3.7.4. Обработка результатов
3.7.4.1. При использовании счетчиков Гамма-800 или фирмы ЛКВ и соответствующей программы расчет концентрации инсулина автоматический.
В случае самостоятельного расчета количество инсулина в 1 см3 разбавленного экстракта находят по калибровочной кривой. Для построения калибровочной кривой необходимо провести следующие расчеты.
Находят средние арифметические значения скоростей счета 125/-инсулина для каждой пары пробирок (В).
Рассчитывают значение^- -200% для каждой калибровочной
•и определяемой пробы,
где В — средняя скорость счета в пробирках, содержащих калибровочные пробы или определяемые образцы, имп/мин;
Bq— средняя скорость счета в пробирках, содержащих «нулевую» калибровочную пробу, имп/мин.
Рассчитывают значение ~ -100%»
где Т—общая активность 1251-инсулина, добавляемого в одну пробирку, характеризующая связывающую способность антисыворотки или процент связанной метки для нулевого счета в пробирках, содержащих «нулевую» калибровочную пробу.
После проведения расчетов в линейных координатах строят калибровочную кривую, откладывая на оси ординат значение — •100%, а на оси абсцисс — значение концентрации калибро-•Оо вочных проб инсулина в мкЕд/см3, добавленного в одну пробирку. Для определяемых проб экстракта поджелудочной железы на основании соответствующих значений • 100% по калибровочного
му графику определяют концентрацию инсулина в 1 см1 2 разбавленного ра-створа.
Массовую долю инсулина в поджелудочной железе (Х<) в Ед/кг вычисляют по формуле
3.7.4.3. Допускаемое расхождение между результатами двух параллельных определений при Р = 0,95 не должно превышать. 17% по отношению к среднему арифметическому значению.
3.7.4.4. Допускаемое расхождение между результатами испытаний, проведенных в двух разных лабораториях, при. Р = 0,95 недолжны превышать 20% по отношению к среднему арифметическому значению.
4. ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ
4.1. Транспортирование
Замороженные поджелудочные железы транспортируют всеми видами транспорта при температуре не выше минус 20°С в соответствии с правилами перевозок скоропортящихся грузов, действующими на соответствующем виде транспорта.
Транспортирование замороженных поджелудочных желез в пакетированном виде — по ГОСТ 24597, ГОСТ 21650, ГОСТ 26663.
4.2. Хранение
Замороженные поджелудочные железы хранят в упакованном: виде в камере при температуре не выше минус 20°С.
Срок хранения замороженных поджелудочных желез — 6 мес с момента сбора.
Хранение замороженных поджелудочных желез на складах транспортных организаций не допускается.
ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ
1. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Всесоюзным научно-исследовательским и конструкторским институтом мясной промышленности и Всесоюзным научно-исследовательским институтом кровезаменителей и гормональных препаратов РАЗРАБОТЧИКИ:
М. М. Расулов, канд. мед. наук; В. П. Илюхина, канд. техн, наук; Е. К). Куликова; П. П. Веселова, Л. Н. Бондарева, канд. техн, наук, М. Ф. Пак
2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 26.10.92 № 1453
3. Срок проверки — 1997 г., Периодичность проверки — 5 лет
4. ВЗАМЕН ГОСТ 11285—73
5. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ
Обозначение НТД.
Обозначение нтп.
на который дана
Номер пункта
на который дана
Номер пункта
ссылка
ссылка
ГОСТ 61-75
3.6.1
ГОСТ 21650—76
4.1
ГОСТ 245—76
3.7.1
ГОСТ 23094-78
3.5.1
ГОСТ 1770—74
3.6.1, 3.7.1
ГОСТ 24104-88
3.4.1, 3.5.1,
ГОСТ 3117—78
3.6.1
3.6.1, 3.7.1
ГОСТ 3118—77
3.6.1, 3.7.1
ГОСТ 24597—81
4.1
ГОСТ 3760-79
3.6.1
ГОСТ 25336—82
3.4.1, 3.5.1,
ГОСТ 3769—78
3.7.1
3.6.1, 3.7.1
ГОСТ 3773-72
3.6.1
ГОСТ 26663-85
4.1
ГОСТ 4IG25—83
3.6.1. 3.7.1
ГОСТ 27544—87
3.3.1, 3.5.1,
ГОСТ 4165—78
ЗЛ)
3.6.1, 3.7.1
ГОСТ 4172—76
3.7.1
ТУ 6-02-1244-
3.4.1
ГОСТ 4204-77
3.5.1, 3.6.1
83
ГОСТ 4328—77
3.6.1, 3.7.1
ТУ 6- 09-1926—
3.6.1
ГОСТ 5556—81
3.6.1
77
ГОСТ 5830— 79
3.5.1
ТУ 6—09—3719—
3.6.1
ГОСТ 5962-67
3.6.1, 3.7.1
74
ГОСТ 630(06—78
3.6.1
ТУ 46-22—761 —
3.5.1
ГОСТ 6552—80
3.7.1
77
ГОСТ 6709—72
3.6.1, 3.7.1
ТУ 6-05-211 —
3.6.1
ГОСТ 9412—77
3.6.1
971—75
ГОСТ 1ХМ354—82
1.3.2
ТУ 64—1 — 1505—
3.7.1
ГОСТ 12026—76
3.4.1, 3.6.1, 3.7.1
79
ГОСТ 13361-84
1.3.1
ТУ П52.706.003.81
3.7.1
ГОСТ 13513—86
1.3.1
ТУ П58.523.490.75
3.7.1
ГОСТ 14192—77
1.2.2
ТУ 7506804-97-
3 4.1
ГОСТ 20292—74
3.5.1, 3.6.1
90
ГОСТ 20469-81
3.6.1
Редактор С. В. Жидкова Технический редактор В. Н. Прусакова Корректор В. И. Кануркина
Сдано в наб. 25.11.92 Поди в печ 01.02.99 Усл. печ. л. 1,25. Усл. хр.-отт. 1,25. Уч.-и.чд. л. 1,30. Тир. 448 эка.
Ордена «Знак Почета* Издательство стандартов, 107076, Москва. Колодезный пер., 14.
Тип. «Московский печатник». Москва, Лялин пер., 6. Зак. 1685
1
IO/w-10*
2
где сх— концентрация инсулина, найденная по калибровочному графику для соответствующего разведения, мкЕд/см3;