ГОСТ Р 51197-98
(ИСО 4133-79)
Группа Н19
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
МЯСО И МЯСНЫЕ ПРОДУКТЫ
Метод определения глюконо--лактона
Meat and meat products. Method for determination of glucono--lactone content
ОКС 67.120.10
ОКСТУ 9209
Дата введения 2000-01-01
Предисловие
1 РАЗРАБОТАН Московской государственной академией пищевых производств
ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 "Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность"
2 ПРИНЯТ И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 28 августа 1998 г. N 335
3 Настоящий стандарт представляет собой аутентичный текст международного стандарта ИСО 4133-79 "Мясо и мясные продукты. Определение содержания глюконо--лактона" с дополнительными требованиями, отражающими потребности экономики страны (6.6, 6.8, 6.12, 7.1 и 9.1)
4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
5 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Январь 2010 г.
1 Область применения
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на мясо и мясные продукты и устанавливает метод определения глюконо--лактона.
2 Нормативные ссылки
ГОСТ 9793-74 Продукты мясные. Методы определения влаги
ГОСТ Р 51447-99 (ИСО 3100-1-91) Мясо и мясные продукты. Методы отбора проб
3 Определение
Массовая доля глюконо--лактона - массовая доля глюконо--лактона, определенная в соответствии с настоящим стандартом и выраженная в процентах.
4 Сущность метода
Глюконо--лактон экстрагируют из пробы продукта, взятой на испытание, ледяным раствором хлорной кислоты. Смесь центрифугируют, фильтруют, затем проводят гидролиз глюконо--лактона, содержащегося в фильтрате, гидроксида калия с образованием глюконата.
Преобразуют глюконат в 6-фосфоглюконат в ходе реакции с аденозин-5-трифосфатом (АТФ) в присутствии глюконаткиназы (ГК):
глюконат + АТФ 
6-фосфоглюконат + АДФ.
Восстанавливают 6-фосфоглюконатом эквивалентное количество никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФ) в присутствии 6-фосфоглюконатдегидрогеназы (6-ФГДГ):
6-фосфоглюконат + НАДФ 
НАДФН + СО + Н + рибулозо-5-фосфат.
Измеряют массовую долю образовавшейся восстановленной формы никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФН) на спектрофотометре при длине волны 365 нм.
5 Реактивы
Все реактивы должны быть аналитического качества (не ниже х.ч.). Все растворы, кроме растворов неорганических соединений (5.1 и 5.2), должны храниться в закрытой посуде из темного стекла, тщательно вымытой и пропаренной или стерилизованной.
Вода, используемая для приготовления растворов ферментов, должна быть деминерализованной или бидистиллированной, полученной в стеклянном дистилляторе.
Вода, используемая для приготовления растворов химических реагентов и подготовки проб, должна быть дистиллированной или деминерализованной.
Примечание - Однократно дистиллированная вода может содержать ионы металлов, которые снижают активность ферментов, а деминерализованная вода может содержать микроорганизмы, увеличивающие неспецифическую фоновую ферментативную активность и искажающие результаты анализа.
Препарат НАДФ должен содержать не менее 90% основного вещества.
Допускается использовать имеющиеся в продаже готовые наборы реактивов при условии соответствия их качества требованиям настоящего стандарта.
5.1 Раствор хлорной кислоты (HClO)=0,4 моль/дм
17,3 см раствора хлорной кислоты массовой доли 70% и плотности 1,67 г/см помещают в мерную колбу вместимостью 500 см и доводят объем раствора до метки водой.
Примечание - При использовании хлорной кислоты меньшей массовой доли проводят перерасчет объема кислоты, используемого для осаждения белков.
5.2 Раствор гидроксида калия (KOH)=2 моль/дм
Растворяют 56,1 г гидроксида калия в воде, доводят объем раствора до 500 см.
5.3 Буферный раствор активной кислотности 8,0 рН
Растворяют 2,64 г глицилглицина (СНNO) и 0,284 г хлорида магния гексагидрата (MgCl·6НО) в 150 см воды. Устанавливают активную кислотность раствора 8,0 рН при 20 °С раствором гидроксида калия (5.2), используя для измерений рН-метр. Доводят объем раствора до 200 см.
Раствор устойчив не менее 1 мес при температуре 4 °
С.
5.4 Раствор НАДФ
Растворяют 50 мг динатриевой соли никотинамидадениндинуклеотидфосфорной кислоты (НАДФ-Na) в 5,0 см воды.
Раствор устойчив не менее 1 мес при температуре 4 °С.
5.5 Раствор аденозин-5-трифосфата (АТФ)
Растворяют 250 мг динатриевой соли аденозин-5-трифосфорной кислоты (АТФ-Na) и 250 мг гидрокарбоната натрия (NaHCO) в 5,0 см воды.
Раствор устойчив не менее 1 мес при температуре 4 °С.
5.6 Суспензия 6-ФГДГ
Используют поставляемую в готовом виде суспензию 6-фосфоглюконатдегидрогеназы из дрожжей, содержащую 6-ФГДГ концентрации 2,0 мг/см и удельной активности не менее 220 Е/см, а также глюконаткиназу и НАДФН-оксидазу массовых долей не более 0,05% каждого.
Суспензия устойчива не менее 6 мес при температуре 4 °С.
5.7 Суспензия ГК
Используют поставляемую в готовом виде суспензию глюконаткиназы из E.coli, содержащую ГК концентрации 1,0 мг/см и удельной активности не менее 26 Е/см и НАДФН массовой доли не более 0,05%.
Суспензия устойчива не менее 6 мес при температуре 4 °С.
6 Средства контроля и вспомогательные устройства
Обычная лабораторная аппаратура, а также указанная в 6.1-6.11.
6.1 Мясорубка механическая лабораторная, снабженная перфорированной пластинкой с отверстиями диаметром не более 4 мм.
6.2 Миксер лабораторный.
6.3 Центрифуга лабораторная с пробирками номинальной вместимостью 50 или 100 см.
6.4 Иономер или рН-метр диапазоном измерений 1-14 рН и допускаемой погрешностью ±0,05 рН.
6.5 Фильтры бумажные гофрированные диаметром 15 см.
6.6 Колбы мерные вместимостью 100, 200 и 250 см и допускаемой относительной погрешностью ±0,2%.
6.7 Дозаторы пипеточные объемами доз 25 и 100 см и относительной погрешностью дозирования ±1%.
6.8 Пипетки градуированные вместимостью 0,01; 0,05; 0,1; 0,5 и 2,5 см и допускаемой относительной погрешностью ±1%.
6.9 Шпатели пластиковые или палочки стеклянные для перемешивания содержимого кюветы при проведении фотометрических измерений.
6.10 Спектрофотометр (фотометр) со следующими техническими характеристиками: спектральный интервал - не более 10 нм; интервал измерений оптической плотности - от 0,000 до 2,000; погрешность установки длины волны - ±3 нм; среднее квадратическое отклонение случайной составляющей погрешности измерений - не более 0,15%.
6.11 Кюветы фотометрические толщиной поглощающего слоя 10 мм.
6.12 Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 200 г и допускаемой погрешностью ±0,001 г.
7 Порядок подготовки к проведению измерения
7.1 Отбор проб - по ГОСТ Р 51447.
7.2 Пробу массой не менее 200 г, полученную из репрезентативной выборки, хранят в условиях, предотвращающих порчу и изменение состава.
8 Порядок проведения измерений
8.1 Подготовка пробы к проведению измерений
Образец пробы гомогенизируют, дважды пропуская через мясорубку (6.1) и тщательно перемешивая.
Образец хранят не более 24 ч в заполненном доверху, герметически закрытом контейнере таким образом, чтобы предотвратить порчу или изменение состава.
8.2 Навеска для проведения анализа
Взвешивают приблизительно 50 г исследуемого образца с точностью до 10 мг и помещают навеску образца в лабораторный миксер (6.2).
8.3 Приготовление экстракта
8.3.1 К навеске образца в лабораторном миксере добавляют 100 см охлажденного льдом раствора хлорной кислоты (5.1) и гомогенизируют.
8.3.2 Часть гомогенизата помещают в центрифужную пробирку и центрифугируют 10 мин при угловой скорости 3000 мин, затем, осторожно отодвинув слой жира, отфильтровывают супернатант через гофрированный бумажный фильтр (6.5) в коническую колбу вместимостью 200 см. Первые 10 см фильтрата выбрасывают.
8.3.3 50 см подготовленного раствора, который может быть слегка мутным, переносят в стаканчик вместимостью 100 см и доводят активную кислотность раствора до 10 рН раствором гидроксида калия (5.2).
8.3.4 Количественно переносят содержимое стаканчика в мерную колбу вместимостью 100 см и доводят объем раствора до метки водой.
8.3.5 Раствор охлаждают в ледяной бане 20 мин и фильтруют через гофрированный бумажный фильтр (6.5), отбросив первые 10 см фильтрата.
8.3.6 25 см фильтрата переносят в мерную колбу вместимостью 250 см и доводят объем фильтрата до метки водой.
Примечание - Объем фильтрата может быть иным. Его выбирают так, чтобы концентрация (+)-глюконата была приблизительно 0,40 г/дм.
8.4 Определение
8.4.1 Для проведения ферментативной реакции берут две фотометрические кюветы (6.11), в каждую из которых пипеточным дозатором (6.5) добавляют:
- 2,50 см буферного раствора (5.3);
- 0,10 см раствора НАДФ (5.4);
- 0,10 см раствора АТФ (5.5).
Затем в одну кювету вносят 0,20 см экстракта (8.3.6), получая исследуемый раствор, а во вторую - 0,20 см воды, получая контрольный раствор.
В каждую кювету вносят по 0,05 см суспензии 6-ФГДГ (5.6) и тщательно перемешивают содержимое пластиковыми шпателями или стеклянными палочками (6.9).
Содержимое кювет выдерживают 5 мин при комнатной температуре, после чего измеряют оптические плотности относительно воздуха при длине волны 365 нм: - оптическая плотность исследуемого раствора, - оптическая плотность контрольного раствор
а.
8.4.2 В обе кюветы вносят по 0,01 см суспензии ГК (5.7), содержимое кювет перемешивают пластиковыми шпателями или стеклянными палочками (6.9).
Растворы выдерживают от 10 до 15 мин при комнатной температуре. Затем измеряют оптические плотности, повторяя измерения каждые 2 мин до достижения постоянных значений.
Строят графики зависимости оптических плотностей растворов от времени и экстраполируют их на момент внесения фермента ГК (приложение А).
Получают экстраполированные значения оптических плотностей исследуемого () и контрольного () растворов.
8.5 Выполняют два параллельных определения в двух пробах из одного и того же образца (8.1).
9 Правила обработки результатов измерений
9.1 Метод расчета
Массовую долю глюконо--лактона в пробе , %, вычисляют по формуле
где 
;
- молярная масса (+)-глюконовой кислоты;
- массовая доля влаги в пробе, определенная в соответствии с ГОСТ 9793;
- масса навески (8.2), г;
- микромолярный коэффициент оптической плотности НАДФН (=3,5 см/мкмоль при длине волны 365 нм и =6,23 см/мкмоль при длине волны 340 нм);
- объем фильтрата, взятый на определение (8.3.6), см.
За результат измерений принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений при условии выполнения 9.2.
Результат определяют с точностью
0,01%.
9.2 Сходимость
Относительное расхождение результатов двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, не должно превышать 10% среднеарифметического значения.
10 Примечания по методике
10.1 Измерение может быть проведено также при длине волны 340 нм.
10.2 Неорганические соли (ионы фосфата, натрия, калия и аммония) могут замедлять ферментативную реакцию. В таких случаях увеличивают количество фермента. Практика показывает, что при анализе мясных продуктов, содержащих фосфаты, нет необходимости увеличивать количество добавляемого фермента.
10.3 Стабильность готовых суспензий ферментов, как правило, гарантируется производителем в течение гарантийного срока хранения, указанного на этикетке.
Препараты ферментов и буферный раствор должны храниться в холодильнике. Кроме того, растворы ферментов необходимо держать на лабораторном столе в охлажденном состоянии, для чего их помещают в перфорированную металлическую емкость, охлаждаемую льдом.
11 Оформление результатов измерений
В отчете об испытании должны быть указаны:
- используемый метод;
- полученные результаты;
- любые условия проведения испытаний, не установленные данным стандартом и касающиеся подробностей, которые могут повлиять на конечный результат.
В отчете должны быть все данные, необходимые для полной идентификации пробы.
Приложение А (справочное). Пример построения графика зависимости оптической плотности раствора от времени
ПРИЛОЖЕНИЕ А
(справочное)
Электронный текст документа
и сверен по:
официальное издание
Продукты мясные.
Методы анализа: Сб. ГОСТов. -
М.: Стандартинформ, 2010