ГОСУДАРСТВЕННА й СТАНДАРТ СОЮЗА ССР
птица сельскохозяйственна
Методы лабораторно диагностики инфекционного бронхита
Agricultural pouitry Methods of laboratory diagnostics of infectious bronchitis
ГОСТ
25583-83
(CT СЭВ 1744—79)
"°оС,ТаНО“Ле"Ием ГосУДаРетвеннЪго комитета СССР по стандартам от 6 января 1983 г. № 18 срок действия устацовлен
с 01.07.83 до 01.07.88
Несоблюдение Стандарта преследуется по закону
Настоящий стандарт распространяется на кур и устанавливает методы лабораторной диагностики инфекционного бронхита.
Стандарт применяют при диагностировании заболевания птицы в лабораториях ветерина|)НЫХ научно-исследовательских учреждений.
Стандарт полностью соответствует СТ СЭВ 1744—79.
1. Методы ОТБОРА ПРОБ
1.1. Для вирусологичес^ого исследования берут пробы тканей и органов — трахеи, слизистой оболочки носовой полости, почек и легких убитой или только ЧХо павшей птицы, а от взрослой птицы — почек и яйцеводов.
1.2. Для серологическое исследования берут не менее чем от 10 голов птицы^ дважды с интервалом 14—21 сут пробы крови по 5 см3 от каждой птицы. Отстаивают сыворотку крови.
1.3. Пробы органов и T^aHeg Или их 10%-ную суспензию хранят при температуре минус 20°С. Пробы сыворотки крови хранят без добавления консервантов при температуре минус 20°С.
2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Вирусологический метод
Сущность метода заключается в изолировании и идентификации возбудителя заболевания на куриных эмбрионах или на культура кглггеги:
Издание официальное Перепечатка воспрещена
2.1.1. Аппаратура и материалы
Для проведения исследования применяют: термостат с температурой нагрева 37—38°С; инкубатор; ступки фарфоровые;
центрифугу с частотой вращения 3000 об/мин; пробирки стеклянные вместимостью 10, 15 и 20 см3 по ГОСТ 10515—75; овоскоп;
шприцы с иглами;
куриные эмбрионы 9-суточного возраста;
культуру клеток почек куриных эмбрионов или фибробласты; раствор Хенкса; стрептомицин, пенициллин.
2.1.2. Подготовка к исследованию
Пробы органов и тканей растирают в стерильной ступке в изотоническом буферном растворе в соотношении 1 : 10 и экстрагируют в течение 2 ч при 4°С. Суспензию центрифугируют с частотой вращения от 1500 до 2000 об/мин в течение 15 мин. Надосадочную жидкость обрабатывают 2000 ЕД/см3 пенициллина и 2 ЕД/см3 стрептомицина.
2.1.3. Проведение исследования
Обработанную антибиотиками надосадочную жидкость иноку-лируют в дозе 0,2 см3 через воздушную камеру в аллантоисную полость шести куриным эмбрионам 9-суточного возраста.
Зараженные эмбрионы инкубируют при 37,5°С и относительной влажности 60—70% и два раза в день овоскопируют. Эмбрионы, погибшие в течение 24 ч после заражения, не учитывают. Оставшихся в течение 72 ч трех живых эмбрионов убивают охлаждением при температуре 4°С, а остальных собирают и охлаждают через 7 сут после заражения. От первых трех эмбрионов собирают аллантоисную жидкость и хориоаллантоисную оболочку для следующего пассажа, а остальные эмбрионы исследуют на наличие макроскопических изменений.
Проводят четыре последовательных пассажа, вируса на куриных эмбрионах, так как первый пассаж в большинстве случаев не вызывает гибели или изменения эмбрионов.
Идентификацию вируса проводят на 9-суточных куриных эмбрионах в реакции нейтрализации (PH), используя известные специфические антисыворотки как минимум к двум основным серотипам вируса (Massachusets, Connecticut) с индексом нейтрализации антисывороток более 3 lg (см. п. 2.2.3.1), или в реакции нейтрализации в культуре клеток почек куриных эмбрионов или фибробластов (см. п. 2.2.3.2).
2.1.4. Обработка результатов
2.1.4.1. Вирус считают идентифицированным и результат положительным, если эмбрионы, инокулированные смесью испытываемого вируса со специфической антисывороткой, остаются живыми и развиваются нормально, а эмбрионы, инокулированные только испытываемым вирусом, погибают или отстают в развитии; у эмбрионов наблюдается перекручивание тела, сворачивание тела в шар, уменьшается количество амниотической жидкости, оболочки плотно прилегают к эмбриону.
В культуре клеток при положительной реакции специфическая антисыворотка ингибирует цитопатический эффект, вызванный вирусом инфекционного бронхита.
2.1.4.2. При получении отрицательного результата в реакции нейтрализации (это может быть связано с неспецифичностью используемой антисыворотки к присутствующему серотипу вируса— Massachusets, Connecticut) проводят реакцию преципитации в агаровом геле (РПАГ) по п. 2.2.3.3.
2.2. Серологический метод
Сущность метода заключается в выявлении у переболевшей птицы специфических антител в реакции нейтрализации (PH) и реакции преципитации в агаровом геле (РПАГ).
2.2.1. Аппаратура, материалы и реактивы Для проведения исследования применяют: баню водяную;
термостат с температурой нагрева 37—38°С; центрифугу с частотой вращения 3000 об/мин; пробирки вместимостью 10, 15 и 20 см3 по ГОСТ 25336—82; пипетки градуированные вместимостью 1, 2, 5 и 10 см3 по ГОСТ 20292_74-
чашки Петри по ГОСТ 25336—82;
штамп для изготовления лунок в агаре;
воронку по ГОСТ 25336—82;
пенициллин;
стрептомицин;
агар очищенный;
мединал;
куриные эмбрионы 9-суточного возраста;
культуры клеток почек куриных эмбрионов, выращенные на среде с 10%-ной телячьей сывороткой;
среды питательные для культуры клеток;
антисыворотки типоспецифические к инфекционному бронхиту, положительные;
штаммы эталонные вирусов инфекционного бронхита разных антигенных типов;
натрий хлористый по ГОСТ 4233—77, 0,87%-ный растввр; воду дистиллированную по ГОСТ 6709—72.
2.2.2. Подготовка к исследованию
Пробы сыворотки крови инактивируют прогреванием при температуре 5б°С в течение 30 мин. Загрязненную сыворотку фильтруют через бактериальные фильтры или обрабатывают антибиотиками.
2.2.3. Проведение исследования в реакции нейтрализации на куриных эмбрионах
2.2.3.1. В реакции используют вирус с титром не ниже 107 ЭИД 50/1 см3. Готовят серийные десятикратные разведения вируса от 10_3 до 10-8. Равные количества разведенного вируса, специфических антисывороток и испытываемых сывороток крови смешивают и смесь оставляют на 1 ч при комнатной температуре.
Каждым разведением инокулируют по четыре куриных эмбриона 9-суточного возраста в аллантоисную полость в дозе 0,2 см3. Инокулированные куриные эмбрионы овоскопируют ежедневно в течение 3—8 сут (в зависимости от используемого штамма); погибшие эмбрионы в течение первых 24 ч не учитывают.
2.2.3.2. Обработка результатов
По истечении 3—8 сут определяют инфекционный статус каждой группы инокулированных куриных эмбрионов и вычисляют ИД50. Разница между логарифмами титра контрольного ряда вируса и титра смеси вируса с испытываемой сывороткой выражает индекс нейтрализации.
При значениях индекса нейтрализации от 0,0 до 1,0 результат реакции считают отрицательным, от 1,1 до 2,0 — сомнительным, от 2,1 и выше — положительным.
Если для 20 и более процентов испытываемых сывороток крови получится сомнительный результат, исследование проводят в реакции преципитации в агаровом геле. При получении сомнительных результатов проводят исследование сывороток крови, полученных при повторном взятии крови от птицы на 14—21 сут. Вируснейтрализующие антитела образуются через 2—3 недели после вспышки заболевания и сохраняются пожизненно, а преци-питирующие антитела — от 2 до 7 недель после начала заражения.
2.2.4. Проведение исследования в реакции нейтрализации на культурах клеток
2.2.4.1. Берут свежеполученную культуру клеток при образовании сплошного монослоя и адаптированный к культурам клеток вирус с титром 5—5,5 ед/см3.
Готовят серийные 10-кратные разведения вируса до 10-6. Каждое разведение вируса смешивают с равным количеством типоспецифической сыворотки. Если в реакции используются кроличьи контрольные сыворотки (положительная и отрицательная), их разводят до 10”1, так как неразведенные сыворотки вызывают неспе
цифическое гранулирование цитоплазмы клетки. Разведение сыворотки учитывают при вычислении индекса нейтрализации. Для каждого разведения вируса и смеси вируса с сывороткой берут по четыре пробирки. Разведения вируса и смеси вируса с сывороткой вносят в каждую пробирку в объеме 0,1 см3, адсорбируют в течение 30—40 мин при комнатной температуре, а затем добавляют поддерживающую среду в объеме 0,9 см3, содержащую 2,5% телячьей сыворотки, и инкубируют при 37,5°С в течение 6 сут.
2.2.4.2. Обработка результатов
Учет реакции ведут по цитопатическому действию вируса. Разница логарифмов титра вируса и смеси вируса с сывороткой считается индексом нейтрализации. Результат реакции определяют по п. 2.2.3.2.
2.2.5. Проведение исследования в реакции преципитации в агаровом геле
2.2.5.1. Очищенный агар от 1,1 до 1,5%, содержащий 8% хлористого натрия и имеющий pH 7,6—7,8, наливают в чашки Петри. Штампом делают лунки (углубления) диаметром 4 или 6 мм на расстоянии 4 мм друг от друга. На дно каждой лунки наносят каплю расплавленного агара; антиген получают из гомогенезирозан-ных хориоаллантоисных оболочек (ХАО) погибших куриных эмбрионов, инокулированных адаптированным к ним штаммом. Выбирают только те ХАО, которые показывают четкую и сильно выраженную реакцию с преципитирующей специфической антисывороткой; сыворотки — контрольные (положительная и отрицательная) и испытуемые должны быть в нативном состоянии и не инактивированными. Чашки Петри выдерживают во влажной камере при температуре 37°С или при комнатной температуре в течение 24—72 ч.
Кроме контрольной положительной и отрицательной сывороток, в РПАГ ставят и контроль на антиген, изготовленный из гомогената ХАО незараженных куриных эмбрионов того же самого возраста.
2.2.5.2. Обработка результатов
Появление линии преципитации между антигеном и сыворотками свидетельствует о положительном результате.
Небольшой процент положительных результатов в реакции преципитации в агаровом геле выявляют в том случае, если заражение птиц происходило за 2—7 недель до исследования.
Если устанавливают большой процент преципитирующих сывороток, стадо птицы считают неблагополучным по инфекционному бронхиту.
Изменение № 1 ГОСТ 25583—83 Птица сельскохозяйственная. Методы лабораторной диагностики инфекционного бронхита
Утверждено и введено в действие Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 17.03.88 № 596
Дата введения 01.07.88
Под наименованием стандарта проставить код: ОКСТУ 9809.
По всему тексту стандарта заменить единицу: об/мин на мин-1.
Пункт 2.1.1. Заменить ссылку: ГОСТ 10515—75 На ГОСТ 25336—82. Пункт 2.1.2. Заменить слова: «изотоническом буферном» на «физиологическом», «Надосадочную жидкость обрабатывают 2000 ЕД/см3 пенициллина и 2 ЕД/см3 стрептомицина» на «В надосадочную жидкость добавляют 2000 ЕД/ см3 пенициллина и 2 мг/см3 стремтомицина, выдергивают при комнатной температуре 1 ч и делают высевы на питательные средь^э.
Пункт 2.1.3. Третий абзац. Заменить слово: «четыре» на «шесть».
(Продолжение см. с. 350}
Пункт 2.1.4.2 исключить.
Пункт 2.2.1. Двенадцатый абзац дополнить словами: «или Пункт 2.2.5.1. Первый абзац после слов «Очищенный агар» «или агар Дифко».
(ИУО Mb б 1988 г.)
агар Дифко». дополнить ело-