ГОСТ Р ИСО 9233-2-2011
НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
СЫРЫ И ПЛАВЛЕНЫЕ СЫРЫ
Определение содержания натамицина
Часть 2
Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии
Cheese and processed cheese. Determination of natamycin content. Part 2. High-performance liquid chromatographic method
ОКС 67.100.30
Дата введения 2013-01-01
Предисловие
1 ПОДГОТОВЛЕН ОАО "Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации" (ОАО "ВНИИС") при участии Государственного научного учреждения "Всероссийский научно-исследовательский институт маслоделия и сыроделия" Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ "ВНИИМС") на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии стандарта, указанного в пункте 4
2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 "Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность"
3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 17 октября 2011 г. N 456-ст
4 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ИСО 9233-2:2007* "Сыры, сырные корки и плавленые сыры. Определение содержания натамицина. Часть 2. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для сыров, сырных корок и плавленых сыров" (ISO 9233-2:2007 "Cheese, cheese rind and processed cheese - Determination of natamycin content - Part 2: High-performance liquid chromatographic method for cheese, cheese rind and processed cheese", IDT).
________________
* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым в тексте, можно получить, обратившись в Службу поддержки пользователей. - .
Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта для приведения в соответствие с ГОСТ Р 1.5-2012 (пункт 3.5)
5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
6 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Ноябрь 2019 г.
Правила применения настоящего стандарта установлены в статье 26 Федерального закона от 29 июня 2015 г. N 162-ФЗ "О стандартизации в Российской Федерации". Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном (по состоянию на 1 января текущего года) информационном указателе "Национальные стандарты", а официальный текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ближайшем выпуске ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)
1 Область применения
Настоящий стандарт устанавливает метод определения массовой доли натамицина свыше 0,5 мг/кг в сырах, сырных корках и плавленых сырах и массы натамицина на единицу площади поверхности свыше 0,03 мг/дм в сырных корках.
2 Термины и определения
В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:
2.1 содержание натамицина (natamycin content): Массовая доля вещества, определенного в соответствии с методикой, установленной в настоящем стандарте.
Примечание - Содержание натамицина выражают в миллиграммах на килограмм.
2.2 масса натамицина на единицу площади поверхности в сырной корке (surface-area-related natamycin mass in cheese rind): Масса натамицина на единицу площади поверхности, определенная в соответствии с методикой, установленной в настоящем стандарте.
Примечание - Массу натамицина на единицу площади поверхности выражают в миллиграммах натамицина на квадратный дециметр сырной корки.
2.3 сырная корка (cheese rind): Наружный слой сыра толщиной 5 мм, за исключением слоя покрытия, если оно присутствует.
3 Сущность метода
Экстрагируют метанолом известное количество пробы. Экстракт разбавляют водой с последующим охлаждением до температуры от минус 15°C до минус 20°C для осаждения большей части жира, а затем фильтруют. Определяют в фильтрате (при необходимости после концентрирования) содержание натамицина или массу натамицина на единицу площади поверхности с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC).
4 Реактивы
Используют только реактивы признанного аналитического качества, если не оговорено иначе, а также только дистиллированную или деминерализованную воду или воду эквивалентной чистоты.
4.1 Метанол (
).
4.2 Метанол, водный раствор.
Смешивают два объема метанола (4.1) и один объем воды.
4.3 Стандартные растворы натамицина
4.3.1 Стандартный основной раствор натамицина концентрацией 500 мг/дм
Непосредственно перед использованием растворяют в метаноле (4.1) в мерной колбе с одной меткой вместимостью 100 см (5.1) количество препарата с известным содержанием натамицина, соответствующее 50 мг чистого натамицина (
). Доводят до метки водой и перемешивают.
4.3.2 Стандартный рабочий раствор натамицина концентрацией 5 мг/дм
В мерную колбу с одной меткой вместимостью 50 см (5.1) отбирают пипеткой 5,0 см стандартного основного раствора натамицина (4.3.1). Разбавляют до метки водным раствором метанола (4.2) и перемешивают. Отбирают пипеткой 5,0 см разбавленного таким образом раствора в другую мерную колбу с одной меткой вместимостью 50 см (5.1). Разбавляют до метки водным раствором метанола (4.2) и перемешивают. Концентрация этого стандартного рабочего раствора натамицина составляет 5 мкг/см. Концентрация должна быть близкой к концентрации испытуемого раствора, измеренной в 8.3.3. При необходимости регулируют концентрацию этого стандартного рабочего раствора путем отбора пипеткой и разбавления другого количества основного раствора.
4.4 Уксусная кислота (
), ледяная.
5 Аппаратура
Обычное лабораторное оборудование и, в частности, следующее:
5.1 Мерные колбы с одной меткой вместимостью 50 и 100 см.
5.2 Ломтерезка или аналогичное устройство, способное нарезать ломтики сыра толщиной 5 мм и шириной примерно 30 мм (см. рисунок A.1).
5.3 Ломтерезка для тонкой нарезки, способная нарезать тонкие ломтики сыра максимальной толщиной 1 мм (см. рисунок A.2).
5.4 Измельчитель или смеситель.
5.5 Острый нож, способный разрезать ломтики сыра на небольшие кусочки.
5.6 Магнитная мешалка или аппарат для встряхивания.
5.7 Конические колбы вместимостью 100 и 200 см, изготовленные из цветного стекла и снабженные притертыми стеклянными пробками.
5.8 Шприцы одноразовые вместимостью 10 см.
5.9 Мембранные микрофильтры с размером пор от 0,20 до 0,45 мкм, стойкие к воздействию спиртовых растворов.
5.10 Складчатые бумажные фильтры, быстрофильтрующие, диаметром 150 мм (например, S и S, No. 595 1/2).
_________________
Пример подходящего продукта, имеющегося в продаже. Эта информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не означает одобрения этого продукта национальным органом по стандартизации.
5.11 Воронка диаметром приблизительно 70 мм.
5.12 Морозильная камера, способная замораживать при температуре от минус 15°C до минус 20°C.
5.13 Экстракционные гильзы для концентрирования при необходимости отфильтрованного экстракта.
5.14 Жидкостный хроматограф с УФ-детектором, способный проводить измерения при длине волны 303 нм и оборудованный регистрирующим устройством и/или интегратором.
5.15 Аналитическая колонка длиной 150 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, типа C8, с размером частиц 5 мкм (например, Lichrosorb RP8).
_________________
Пример подходящего продукта, имеющегося в продаже. Эта информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не означает одобрения этого продукта национальным органом по стандартизации.
5.16 Защитная колонка длиной 100 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, типа C8, с размером частиц от 30 до 40 мкм.
5.17 Емкость для хранения пробы подходящей вместимости.
6 Отбор проб
В лабораторию следует поставлять представительную пробу. Она не должна быть подвержена порче или изменению во время транспортирования или хранения.
Отбор проб не рассматривается в методе, установленном в настоящем стандарте. Рекомендуемый метод отбора проб приводится в ИСО 707.
Лабораторная проба должна составлять целую головку сыра или ее сегмент, представляющий целую головку.
7 Приготовление пробы для испытания
7.1 Сырная корка
При необходимости разрезают пробу для испытания на сектора или более мелкие части так, чтобы ширина сырной корки была не более 30 мм. С помощью ломтерезки (5.2) отделяют всю корку от всех полученных секторов или частей, нарезая ломтиками максимальной толщиной 5 мм. Из полученной корки вырезают с помощью острого ножа (5.5) прямоугольный кусок площадью от 2 до 4 дм. Определяют площадь его поверхности в квадратных дециметрах и массу в килограммах. Тщательно измельчают (5.4) всю корку, включая взвешенный и измеренный кусок, и хорошо перемешивают. Сразу же переносят приготовленную таким образом пробу в емкость для хранения пробы (5.17). После приготовления каждой пробы для испытания очищают все инструменты, которые находились в контакте с пробой, горячей водой, а затем метанолом (4.1). Тщательно сушат все инструменты, например, струей сжатого воздуха.
7.2 Внутренняя часть сыра и плавленый сыр
После удаления корки (7.1) используют ломтерезку для тонкой нарезки (5.3) для получения ломтика максимальной толщиной 1 мм со всего наружного среза пробы для испытания. Нарезают все ломтики пробы на мелкие куски площадью приблизительно 50 мм и хорошо перемешивают. Сразу же переносят приготовленную таким образом пробу в емкость для хранения пробы (5.17). После приготовления каждой пробы для испытания очищают все инструменты, которые находились в контакте с пробой для испытания, горячей водой, а затем метанолом (4.1). Тщательно сушат все инструменты, например, струей сжатого воздуха.
8 Проведение испытания
8.1 Подготовка пробы для анализа
8.1.1 Сырная корка
В коническую колбу вместимостью 200 см (5.7) взвешивают с точностью до 10 мг приблизительно 10,00 г пробы для испытания (7.1).
8.1.2 Внутренняя часть сыра и плавленый сыр
В коническую колбу вместимостью 100 см (5.7) взвешивают с точностью до 10 мг приблизительно 5,00 г пробы для испытания (7.2).
8.2 Приготовление испытуемого раствора
8.2.1 Сырная корка
8.2.1.1 Первоначальная подготовка
В коническую колбу к пробе для анализа (8.1.1) добавляют 100 см метанола (4.1). Перемешивают содержимое конической колбы в течение 90 мин на магнитной мешалке (5.6) или встряхивают в течение 90 мин в аппарате для встряхивания (5.6). Добавляют 50 см воды. Сразу же переносят коническую колбу в морозильную камеру (5.12) приблизительно на 60 мин.
8.2.1.2 Фильтрование
Холодный экстракт фильтруют через складчатый бумажный фильтр (5.10), отбрасывая первые 5 см фильтрата. Фильтрование следует проводить, пока суспензия остается еще холодной, чтобы избежать растворения жира и, следовательно, образования мутных фильтратов. Доводят фильтрат до комнатной температуры. С помощью шприца (5.8) отбирают порцию фильтрата. Фильтруют через мембранный микрофильтр с размером пор 0,45 мкм (5.9), а затем через мембранный микрофильтр с размером пор 0,20 мкм (5.9). Минимальное требуемое количество испытуемого раствора (фильтрата) составляет 20 мкл на ввод для прямого хроматографического измерения (8.3.4) и 25 см или 50 см для измерения при 5- или 10-кратной концентрации (8.3.5) соответственно.
8.2.2 Внутренняя часть сыра и плавленый сыр
8.2.2.1 Первоначальная подготовка
В коническую колбу к пробе для анализа (8.1.2) с помощью измерительного цилиндра добавляют 50 см метанола (4.1). Перемешивают содержимое конической колбы в течение 90 мин на магнитной мешалке (5.6) или встряхивают в течение 90 мин в аппарате для встряхивания (5.6). С помощью измерительного цилиндра добавляют 25 см воды. Сразу же переносят коническую колбу в морозильную камеру (5.12) приблизительно на 60 мин.
8.2.2.2 Фильтрование
Фильтруют раствор, как описано в 8.2.1.2.
8.3 Определение
8.3.1 Определение и пределы обнаружения
Лаборатория, которая применяет данный метод, должна установить пределы обнаружения и провести определение в собственных инструментальных условиях, используя признанные методы расчета, для верификации того, что натамицин может быть определен при концентрациях вплоть до 0,5 мг/кг и 0,03 мг/дм.
8.3.2 Настройка жидкостного хроматографа (5.14)
Рекомендуется следующий хроматографический режим:
- подвижная фаза: метанол (4.1) - вода - уксусная кислота (4.4) - 12:8:1 (объемных частей);
- поток: 1 см/мин;
- установка детектора: 303 нм, 0,005 оптической единицы, вся шкала;
- регистрирующее устройство: 10 мВ;
- число теоретических (типичных) тарелок: минимум 1500.
При использовании другой колонки, отличной от приведенной в качестве примера (5.15), регулируют соотношение метанол:вода. Однако заданное относительное количество уксусной кислоты (4.4) к метанолу является существенным для сохранения максимальной оптической плотности при 303 нм. Для определения времени удерживания и проверки калибровочного графика (8.3.3) перед испытанием каждой серии проб в хроматограф должен вводиться стандарт с известным содержанием натамицина. Поскольку натамицин не устойчив в водном метаноле, выполняют измерение как можно быстрее.
8.3.3 Построение калибровочного графика
Отбирают пипеткой 1, 2, 4, 6 и 8 см стандартного рабочего раствора натамицина (4.3.2) соответственно в серию мерных колб с одной меткой вместимостью 50 см (5.1). Доводят до метки водным метанолом (4.2) и перемешивают. Полученные таким образом калибровочные растворы содержат 0,1; 0,2; 0,4; 0,6 и 0,8 мкг/см натамицина соответственно. Поочередно вводят в колонку по 20 мкл каждого калибровочного раствора. Определяют площадь или высоту полученных пиков. Наносят на график полученные площадь или высоту пика для каждого раствора по оси ординат относительно концентрации натамицина, в микрограммах на миллилитр, по оси абсцисс. HPL-хроматограмма образца приведена на рисунке A.3.
8.3.4 Испытуемый раствор
Вводят 20 мкл испытуемого раствора (8.2.1.2 или 8.2.2.2). Измеряют площадь или высоту пика с таким же временем удерживания, что и калибровочные растворы натамицина. Выполняют измерение по возможности быстрее. Если площадь или высота пика испытуемого раствора настолько мала, что интерполяция по калибровочному графику невозможна или почти невозможна, а определение тем не менее необходимо, следуют методике, указанной в 8.3.5. Примеры HPL-хроматограмм испытуемых растворов приведены на рисунке A.4.
Примечание - Присутствие в сыре специй, особенно перца, может мешать определению, поскольку на хроматограмме может образовываться пик с тем же временем удерживания, что и у пика, соответствующего натамицину. Разделение этих двух пиков может быть достигнуто путем градиентного элюирования или изократического использования альтернативной подвижной фазы метанол (4.1) : фосфатный буфер, pH 4,5 с соотношением 11:9 объемных частей. Раствор фосфата для буферного раствора можно приготовить при растворении 3,026 г дигидроортофосфата калия в 1 дм воды.
8.3.5 Низкое содержание натамицина
8.3.5.1 Концентрирование
Решают вопрос о необходимости использования приблизительно 5- или 10-кратной концентрации. Основывают это решение на результате, полученном в 8.3.4, и на требуемом пределе определения. Затем в химический стакан отбирают пипеткой 25 см или 50 см (для 5- или 10-кратной концентрации соответственно) испытуемого раствора (8.2.1.2). В зависимости от требуемой концентрации добавляют 50 или 100 см воды соответственно и перемешивают. Активируют экстракционную гильзу (5.13), используя от 3 до 5 см метанола (4.1). Затем промывают 10 см воды. Пропускают разбавленный испытуемый раствор через гильзу со скоростью от 3 до 5 см/мин с помощью шприца (5.8). Таким же образом промывают гильзу 10 см воды и элюируют натамицин 3 см метанола (4.1).
8.3.5.2 Измерение с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии
Разбавляют элюат (8.3.5.1) до 5 см метанолом (4.1). Продолжают измерение, как указано в 8.3.4.
9 Расчет и выражение результатов
9.1 Расчет массовой доли натамицина
Массу натамицина во введенной аликвоте испытуемого раствора можно определить путем интерполяции по калибровочному графику (8.3.3).
Содержание натамицина в виде массовой доли , мг/кг, в испытуемой пробе рассчитывают по формуле
, (1)
где - концентрация натамицина в испытуемом растворе (8.2.1.2 или 8.2.2.2), мкг/см;
- масса пробы для анализа (8.1.1 или 8.1.2), г;
- общий объем испытуемого раствора (8.2.1.1 или 8.2.2.1), см.
Примечание - В том случае, если испытуемый раствор приготовлен из сыра, отобранного из-под корки, представляет собой содержание натамицина в результате миграции в сыр.
9.2 Расчет массы натамицина на единицу площади поверхности
Массу натамицина на единицу площади поверхности , мкг/дм, рассчитывают по формуле
, (2)
где - массовая доля натамицина в пробе для испытания, взятой из сырной корки (7.1), мкг/кг;
- масса взвешенного куска пробы для испытания, взятой из сырной корки (7.1), кг;
- площадь взвешенного куска пробы для испытания, взятой из сырной корки (7.1), дм.
9.3 Поправка, вводимая в результат
В том случае, если отфильтрованный экстракт подвергался концентрированию, как указано в 8.3.5, вносят поправку в результаты испытания для (9.1) и (9.2) следующим образом:
a) для приблизительно 5-кратной концентрации делят полученный результат на 5;
b) для приблизительно 10-кратной концентрации делят полученный результат на 10.
Если требуется параллельное определение при условии соблюдения требований к повторяемости, за конечный результат содержания натамицина в пробе для испытания принимают среднеарифметическое результатов двух определений, полученных в соответствии с разделом 10, округленное с точностью до первого десятичного знака.
9.4 Обработка результатов
Выражают результаты испытания с точностью до первого десятичного знака.
10 Прецизионность
10.1 Межлабораторные испытания
Значения повторяемости и воспроизводимости были получены по результатам межлабораторного испытания, проведенного в соответствии с ИСО 5725:1986 [2] (относительно результатов см. [4]).
10.2 Повторяемость
Абсолютное расхождение между результатами двух независимых единичных испытаний, полученными при использовании одного и того же метода на идентичном испытуемом материале в одной лаборатории одним оператором на одном и том же оборудовании в пределах короткого промежутка времени, будет не более чем в 5% случаев превышать значения, указанные в таблице B.1.
10.3 Воспроизводимость
Абсолютное расхождение между результатами двух единичных испытаний, полученными при использовании одного и того же метода на идентичном испытуемом материале в разных лабораториях разными операторами на различном оборудовании, будет не более чем в 5% случаев превышать значения, указанные в таблице B.1.
11 Протокол испытания
Протокол испытания должен содержать:
a) всю информацию, необходимую для полной идентификации пробы;
b) используемый метод отбора проб, если известен;
c) используемый метод испытания со ссылкой на настоящий стандарт;
d) все подробности, не указанные в настоящем стандарте или рассматриваемые как необязательные, вместе с подробностями всех побочных обстоятельств, которые могут повлиять на результат(ы) испытания;
e) полученный(е) результат(ы) испытания и, в случае проверки повторяемости, конечный полученный результат.
Приложение A
(справочное)
Примеры
|
1 - сыр; 2 - нож; 3 - корка; 4 - ролик |
Рисунок A.1 - Пример ломтерезки для нарезания кусков сырной корки толщиной 5 мм (5.2)
|
Рисунок A.2 - Пример ломтерезки для тонкой нарезки ломтиков сыра максимальной толщиной 1 мм (5.3)
|
- оптическая плотность; - время; - оптическая единица
Рисунок A.3 - HPL-хроматограмма образца стандартного раствора, содержащего 0,5 мкг/см натамицина
|
- оптическая плотность; - продолжительность; - оптическая единица; 1 - сырная корка, массовая доля натамицина 61 мг/кг; 2 - сырная корка, массовая доля натамицина 15 мг/кг; 3 - сыр, массовая доля натамицина 1,7 мг/кг; 4 - сыр, массовая доля натамицина 0,3 мг/кг; 5 - как 3, после 5-кратного концентрирования; 6 - как 4, после 10-кратного концентрирования
Рисунок A.4 - Примеры HPL-хроматограмм различных испытуемых растворов
Приложение B
(справочное)
Результаты межлабораторных испытаний
Результаты были получены в соответствии с ИСО 5725 при совместном исследовании, проведенном в 1984 году в 36 лабораториях, которые использовали восемь проб. Значения в миллиграммах на квадратный дециметр были рассчитаны из значений в миллиграммах на килограмм для сырных корок толщиной 5 мм и плотностью 1,3 г/см.
Таблица B.1 - Параметры прецизионности
Натамицин | |||||
Масса на единицу | Массовая доля, мг/кг | Коэффициент вариации | Коэффициент | Относительная | Относительная воспроизводимость, |
4 | 60 | 9,3 | 20,6 | 26 | 60 |
1 | 15 | 7,1 | 25,6 | 20 | 70 |
0,08 | 1,3 | 23,4 | 37 | 65 | 105 |
0,02 | 0,3 | 29 | 39 | 80 | 110 |
Прямое определение. | |||||
, %
, %
, %
, %Библиография
[1] | ISO 707/IDF 50 Milk and milk products - Guidance on sampling |
[2] | ISO 5725:1986 Precision of test methods - Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory tests |
[3] | DE RUIG W.G., VAN OOSTROM J.J., LEENHEER K. Spectrometric and liquid chromatographic determination of natamycin in cheese and cheese rind. J. Assoc. Off. Anal. Chem., 1987, 70, pp. 944-8 |
[4] | DE RUIG W.G. Determination of natamycin in cheese and cheese rind: Interlaboratory collaborative study. J. Assoc. Off. Anal. Chem., 1987, 70, pp. 949-54 |
___________________
Заменен на ISO 5725-1:1994
УДК 633.11:006.354 | ОКС 67.100.30 | |
Ключевые слова: сыры, плавленые сыры, натамицин, высокоэффективная жидкостная хроматография, сырная корка | ||
Электронный текст документа
и сверен по:
, 2019